犬瘟热水貂病诊断与基因分析

犬瘟热水貂病诊断与基因分析

狗瘟疫是由狗、毛发动物和某些海洋哺乳动物引起的一种高度接触的烈性传染病。犬瘟热病毒为副黏病毒科麻疹病毒属成员,单股负链RNA病毒,是引起犬及其他食肉目动物犬瘟热的病原。基因组长15690bp,由7个基因组成,分别编码N、P、M、F、H、L蛋白,其中H蛋白是CDV囊膜表面的糖蛋白之一,CDV通过H蛋白吸附到细胞表面受体上,因此H蛋白决定CDV宿主特异性,并协助F蛋白使病毒以囊膜与宿主细胞发生融合的方式进入宿主细胞。蛋白基因序列的系统分析结果表明,CDV存在不同的基因型,在麻疹病毒属所有结构蛋白中,H蛋白基因变异最大,抗原变化最高。在免疫压力下,H蛋白抗原容易发生漂变,因而免疫水貂也有可能爆发犬瘟热。这也可能是目前犬瘟热免疫失败的原因。该病一年四季都有发生,其潜伏期为3~7d。典型病例临床症状主要有消化系统症状、呼吸系统症状、神经系统症状、皮肤丘疹和足底变化等。解剖病理变化主要表现为肺脏、肝脏出血,胃肠道卡他性炎症,脑出血,脾肿大等症状。本研究通过对2012年11月中旬一水貂养殖场疑似犬瘟热发病水貂进行临床、解剖诊断,制作病理切片,并对其进行H基因序列分析,比较全面的对犬瘟热进行检测观察,为更好的研究犬瘟热及犬瘟热的防治提供参考依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1家庭环境情况患病种貂来自青岛市红岛地区某水貂养殖场,现在养殖场有种貂1800只,貉子40只,最近3～4天出现零星死亡情况,6月份已进行犬瘟热和肠炎免疫,无既往病史。1.1.2dna试剂和试剂CDV、CPV检测试剂盒,鲁戈氏碘液,革兰氏染色试剂,感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α为笔者所在实验室保存;克隆载体pMD18-T,限制性内切酶NdeⅠ,rTaq和MLV均购自宝生物工程(大连)有限公司;SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;光学显微镜,组织切片机,凝胶成像系统。1.2方法1.2.1cdv和cpv试剂盒的检测用灭菌棉签(棉拭子)粘取患貂眼角分泌物、鼻液、粪便排泄物等分泌物样品,放入装有稀释液的试管中充分搅拌混合,用吸管抽取上清液,向CDV和CPV试剂盒样品孔中滴加4～5滴上清液,待3～5min后,观察实验结果。将速眠新对水貂皮下注射进行麻醉,心脏采血,放入10mL离心管,置37℃2h后,5000r/min离心10min,将析出的血清取一滴于载玻片上,加等量的新配置的碘液与之混合均匀置照明箱上观察。剖检后按常规方法进行绿脓杆菌、巴氏杆菌的涂片镜检及分离培养,在光学显微镜下进行观察。1.2.2临床观察观察主要对送检病貂的眼鼻分泌物、脚垫厚度、精神状态、呼吸情况、粪便情况进行临床观察。用速眠新将患病水貂皮下注射进行麻醉后,对其进行剖检,并进行组织器官病理学观察。1.2.3肝脏组织病理学染色将患病水貂组织器官(脑、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、小肠)进行固定、水洗、脱水、透明、石蜡包埋、切片,脱蜡、水洗,并进行HE染色。显微镜下对组织切片进行观察。1.2.4rna核酸的提取用灭菌剪刀将患病水貂组织剪碎。按1:3比例与PBS进行混合均匀并放入研磨器中进行研磨,加入双抗,将研磨液倒入10mL离心管中,5000r/min离心10min,取上清利用Trizol进行RNA核酸提取。按照本实验室建立的犬瘟热一步PCR方法扩增CDVN基因,预期扩增片段大小为287bp。1.2.5h基因rt-pcr-rflp分析H基因的扩增及序列分析:根据Genbank登录的H基因序列设计特异性引物,将提取的核酸RNA进行反转录,PCR扩增H基因。根据H基因RT-PCR-RFLP分析方法区分CDV疫苗株与野毒株,将H基因PCR产物用NdeⅠ进行酶切分析;该利用胶回收试剂盒将H基因进行回收、连接、转化,挑取单菌落进行阳性筛选。将阳性克隆质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序结果与GenBank上不同基因型CDV参考株H基因序列进行比较,用MegAlign软件进行核苷酸同源性比较、进化树分析等。2结果2.2.1胶体金属酶检测对患病水貂进行犬瘟热和病毒性肠炎检测结果显示,CDV胶体金检测试剂盒在T线和C线出同时出现了红色显色线,而CPV胶体金检测试剂盒只在C线处出现了红色显色先而T线处则没有出现红色显色线,即该水貂为CDV强阳性,CPV阴性。经观察,载玻片上鲁戈氏碘液无凝集现象,即无阿留申病毒感染。革兰氏染色结果显示,患病水貂主要组织器官肺脏、肝脏、脾脏均无发现任何细菌。2.2.2呼吸异常严重从患病水貂临床情况观察,发现眼鼻有大量脓性分泌物,脚垫红肿发硬,精神极度萎靡,呼吸困难,粪便呈黑色,体温在41℃左右,呼吸急促。患病水貂组织呈现明显的病理变化,主要表现为:肺组织大面积肉样出血变性,脾肿大出血,肾脏肿大呈黄褐色,肠粘膜有出血现象,肝脏黄染及胆囊肿大明显,并充满深绿色浓稠胆汁,膀胱积尿显著。2.2.3肝组织病理学表现对患病水貂不同组织器官进行切片染色发现,肾脏有出血、炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞脱落坏死,脾出血、脾小梁增生、淀粉样变性,肺泡壁减少甚至出现消失情况,肝淤血、出血、炎性细胞浸润,广泛性肝细胞坏死,脂肪变性并出现包浆包涵体,脑组织有出血淤血现象(图1～6)。2.2.4rt-pcr检测经RT-PCR检测在287bp左右出现与阳性对照大小一致的目的条带,且阴性对照无目的条带(图7)。2.2.5犬血髓炎对h基因表达的毒株利用RT-PCR方法检测出样品中的H基因,大小在1921bp左右,与阳性对照中H基因大小相符,H基因PCR产物经NdeⅠ酶切后出现了1282bp、345bp和294bp三条条带,与阳性对照相符,即该毒株为犬瘟热野毒株(图8)。2.2.5.基因序列及氨基酸序列将阳性克隆质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序,得到样品中CDVH基因编码区全基因序列(全长1824bp,编码607个氨基酸)。该毒株H基因与野毒株2544、48/05、98002、SD(07)1的同源性在92.6%～95.7%,与疫苗株CDV3、Convac、Lederle、Onderstepoort的同源性在90.9%～91.6%。2.2.5.核苷酸序列及系统发育进化树分析将测得的该毒株H基因序列和国内外CDV毒株核苷酸序列利用MegAlign软件构建系统发育进化树,测得该CDV毒株为Asia-1型(图9)。3分离后产生的病理变化经实验室诊断该患病水貂为典型的单纯犬瘟热感染,临床上出现了典型症状,即眼鼻出现大量黏性分泌物,脚垫有明显增厚现象,此种现象为今年水貂疾病临床上最典型的现象。该水貂组织器官有着不同程度的病理变化,主要表现为肺脏出血,肝脏黄染,肠粘膜出血、脱落,其中胆囊肿大严重和膀胱积尿为此患病水貂最为典型的病理变化,在此之前的水貂病理解剖观察中无此病理变化。患病水貂的组织病理切片结果表明,脾脏出现大量炎性浸出细胞,淋巴细胞减少并坏死,此种情况可能与免疫抑制现象有关。肺脏组织充血明显,且肺泡壁消失,这是导致呼吸困难,甚至导致窒息死亡的主要原因。通过制备病理切片在显微镜下观察,可以更好地做出病理诊断,为犬瘟热临床诊断和治疗提供帮助。该毒株H基因测序结果及序核苷酸序列分析显示,感染该患病水貂的犬瘟热病毒基因型为亚洲Ⅰ型,与我国当前流行毒株一致。该貂场发生犬瘟热疾病主要原因可能是因为该地区流行的野毒株与国内使用的疫苗株差距较大,疫苗不