去势大鼠骨形成过程中骨吸收指标的变化及其相关性研究

去势大鼠骨形成过程中骨吸收指标的变化及其相关性研究

骨转化生化指标反映了血液和尿液中各种物质的骨吸收和形成。反映骨形成的生化指标主要有血清骨钙素(osteocalcin,OC)、血清总碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨碱性磷酸酶(bone-specificalkalinephosphatase,BALP)和血清Ⅰ型前胶原C末端前肽(procollagentypeⅠCpropeptide,PICP)。反映骨吸收的生化标志物主要有血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)、血、尿羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)、尿Ⅰ型胶原N末端交联肽(N-terminalcross-linkingtelopeptideoftypeⅠcollagen,NTX-1)和尿脱氧吡啶酚(deoxypyridinoline,DPD)。骨转换指标的研究对阐明绝经后骨质疏松症的发病机制、预测绝经后骨量的丢失、寻找早期诊断和观察药物疗效的灵敏指标具有重要意义。2003年,Legrand等研究去势老年雌猴模型中一些标志物的动态变化,2004年Miyazaki等报道去势大鼠术后一些骨转换指标随时间的变化趋势,我室曾对去势兔血清TRAP和BALP的动态变化进行了研究。本研究拟对去势大鼠模型形成过程5种骨转换指标(OC、ALP、BALP、TRAP和HYP)的变化及其相关性进行研究,从而预测它们在绝经后早期骨量丢失中的意义。材料和方法1材料表面1.1实验动物3月龄SD雌性大鼠48只,平均体重(183±23)g,由四川大学实验动物中心提供。1.2高温水浴箱UV-265型紫外分光光度计(日本岛津公司),DG3022A型酶标仪(南京华东电子管厂),IB-85型超级恒温水浴箱(日本岛津公司),40孔微量反应板(浙江黄岩拱东塑料制品厂);对硝基酚磷酸二钠盐(PNPP)购自德国Merck公司,酒石酸钠及对硝基酚购自成都化学试剂厂,其它化学试剂均为国产分析纯。2方法2.1对照组控制随机将大鼠分为3组:去势组即卵巢切除组(OVX)30只,假手术组(sham)12只,对照组(control)6只。平衡膳食1周后,OVX和sham大鼠在3%戊巴比妥钠腹腔注射(35mg/kgBW)麻醉下进行手术,OVX开腹后切除双侧卵巢,sham仅开腹,不切除卵巢,两组均缝合腹腔、闭合伤口,分组分笼复合饲料饲养。2.2术后时间检查术前对照组心脏采血,分离血清于-30℃保存。OVX组和sham组术后分别于1、1.5、2、2.5、3和4月6个时点,乙醚麻醉大鼠(OVX组5只,sham组2只)后从心脏采血,分离血清于-30℃保存,处死大鼠后分离右腿胫骨,浸泡于10%甲醛溶液中,留作病理切片检查。2.3trap活性的检测血清中OC的含量采用间接ELISA法检测。血清总ALP和BALP采用热失活法检测。BALP=总ALP-肝ALP。以37℃,pH9.8,每分钟催化生成1μmol对硝基酚的酶量为1个酶活性单位(U)。采用对硝基酚磷酸盐法检测TRAP活性。以37℃,pH5.5,在80mmol/L酒石酸钠存在条件下,每分钟催化生成1μmol对硝基酚的酶量为1个酶活性单位(U)。血清中的HYP含量用盐酸水解法进行检测。2.4骨小梁的变化和破骨细胞的观察将大鼠右腿胫骨近端1/3沿冠状面磨平,常规甲醛固定,10%EDTA脱钙,石蜡包埋处理后切片,HE染色,在光镜下观察骨小梁的变化和成骨、破骨细胞的数量并摄像。3统计处理采用SPSS10.0统计软件包处理数据。结果以x¯±sx¯±s表示,差异分析用方差分析和t检验,相关分析用Pearson分析法。结果1各组小鼠血清oc、alp、balp水平大鼠血清OC、ALP和BALP的水平见表1。表1显示:OVX组血清OC、ALP和BALP水平均高于sham组,其中OVX组血清BGP含量在术后1.5-3月与sham组比差异显著,OVX组血清ALP和BALP水平在术后1.5-4月与sham组比均差异显著。2ovx组血清alp活性在术后由图1所示,OVX组血清OC的含量在术后迅速升高,并在2月达峰值,然后迅速下降,术后4月降至术前水平;OVX组血清ALP活性在术后缓慢上升,在术后2.5月达峰值,然后缓慢下降,4月时仍高于术前水平;BALP在术后的上升与血清ALP相似,在术后2.5月达峰值,然后迅速下降,3月时降至术前水平。3血清trap活性和hyp含量大鼠血清TRAP和HYP水平见表2。表2表明,OVX组血清TRAP活性和HYP含量均高于sham组,且在术后1-4月与sham组比均差异显著。4两组活性和hyp含量的比较由图2所示,OVX组血清TRAP活性和HYP含量的变化相似:在术后迅速升高,并在术后1.5月达峰值,然后下降,术后4月时仍高于对照组。5家庭暴力0.713去势大鼠血清OC含量与血清ALP、BALP、血清TRAP水平和血清HYP含量均呈非常显著正相关(r=0.448、0.730、0.388和0.292,P<0.01);血清ALP水平与BALP、血清TRAP和HYP水平呈非常显著正相关(r=0.739、0.420和0.313,P<0.01);BALP水平与血清TRAP和HYP水平呈非常显著正相关(r=0.569和0.424,P<0.01);血清TRAP水平和HYP含量呈非常显著正相关(r=0.690,P<0.01)。6两组患者术后3月软骨小梁变细、排列稀疏、断裂率比较OVX组术后1-2.5月其胫骨小梁结构正常(结果未显示)。由图3可见,与sham组相比,OVX组术后3月胫骨小梁变细,排列稀疏,部分断裂(图3B);OVX组术后3月胫骨小梁周围的成骨和破骨细胞增生活跃(图3D)。骨转换生化指标去势大鼠是研究绝经后骨质疏松症的发病机制和观察药物疗效的经典动物模型。目前已有多种手段来监测动物模型的骨组织状态,包括骨组织形态学观察、骨密度测量、骨生物力学研究和骨转换生化指标的检测等,其中生化指标的检测具有简便、快速、无创伤性、可以对骨组织进行动态监测等优点而受到广泛关注。我们选用3月龄雌性大鼠摘除卵巢建立动物模型可排除老年性原因引起的骨质疏松,从而研究单纯由于雌激素缺乏所致的绝经后骨质疏松症。病理切片显示:术后3月去势组大鼠胫骨小梁变细、稀疏、部分断裂等,说明绝经后大鼠骨质疏松模型复制成功。骨转换生化指标的检测结果表明,OVX组骨形成和骨吸收指标的水平均高于sham组,术后3月,骨吸收指标TRAP处于高水平,而骨形成指标BALP已降至术前水平,这说明绝经后骨吸收和骨形成之间的平衡被破坏,使骨吸收超过骨形成,为高转换型骨质疏松。本研究结果表明,骨转换指标OC、ALP、BALP和TRAP的变化趋势与Legrand等和Miyazaki等研究结果相似,只是达峰值的时间不同。我们估计是所用动物种系、检测的时点及检测方法不同所致。在去势大鼠骨质疏松模型形成过程中,如果以达峰值时间为准,骨转换指标发生变化的先后顺序依次为:TRAP/HYP→OC→ALP/BALP,这说明骨吸收的变化先于骨形成的变化,即破骨在前,成骨在后。摘除卵巢后,雌激素缺乏,首先激活破骨细胞,启动骨吸收过程;继而促使成骨细胞活性代偿性升高,进行骨形成作用。这可能是雌性绝经后骨转换增强,骨代谢处于负平衡,而使骨量快速丢失的原因。实验结果表明,5种骨转换生化指标(OC、ALP、BALP、TRAP和HYP)之间均呈显著正相关,说明骨吸收和骨形成不是独立的过程,而是相互联系和相互调节的。其中ALP和BALP的相关性最高(r=0.739),提示血清ALP的变化主要是由骨源性BALP引起的。有报道去势雌猴血清OC和ALP、ALP和BALP之间呈显著正相关,与本研究结果一致,去势模型中其它指标之间的相关性目前尚未见报道。本研究结果显示,去势组大鼠骨质疏松的病理变化一般在术后3月才能从切片观察到,而