生物发酵法制备放射毛霉制备壳聚糖的研究

生物发酵法制备放射毛霉制备壳聚糖的研究

甲壳素，也称为三丁素和甲壳素，是一种广泛存在于自然界的天然聚合物。它的学名为n-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖，方程式为（c8h13no5）n。甲壳素是其次的自然资源。壳聚糖(Chitosan)又称聚氨基-D-葡萄糖,是甲壳素部分脱去乙酰基的产物。甲壳素和壳聚糖在医学、药物制剂学、印染、化工、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的用途。与甲壳质相比,壳聚糖的溶解度大为改善,因而其应用范围也更广。壳聚糖的提取,目前主要是以蟹、虾为原料,也有以蝇蛹壳,宽跗陇马陆和蝉蜕为原料用化学方法提取,国内尚未见以丝状真菌为原料提取壳聚糖的详细报道。本研究介绍一种新的壳聚糖制备方法:以丝状真菌发酵时形成的菌丝体为原料,利用其细胞中存在的甲壳素合成酶和甲壳素脱乙酰酶的自身催化作用,把其细胞内容物尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡萄糖胺转变成壳聚糖,并研究了各制备条件对产品产率的影响,以期为工业生产提供可靠的数据。1实验1.1种子溶液培养基的制备和消毒采用本实验室的种子液培养基配方配制100mL的种子液,在0.1MPa压力下消毒30min。1.2优雅中的辐射细菌育种采用经过筛选的第三代雅致放射毛霉(Accimonueorelegams)在无菌操作台上接种,并放入恒温摇床内培养。1.3发酵培养液的配制采用本实验室发酵液培养基的配方,在250mL锥形瓶中配成若干份50mL的发酵培养液做批量实验。发酵液在0.1MPa压力下消毒30min。1.4引进和发酵在无菌操作台上引5mL含有雅致放射毛霉的种子液于每瓶50mL发酵培养液中,放入恒温摇床发酵。1.5地壳聚糖提取菌种培养后取菌丝充分冲洗干净烘干称重,先用稀碱加热脱蛋白,再用稀酸处理提取壳聚糖,具体方法参见文献。1.6产品的红外谱图定性分析产品壳聚糖干燥,粉碎后,通过Nicolet550型FTIR光谱仪采用KBr压片法测得红外光谱图,并与从虾壳制备的壳聚糖作对比。1.7产品x的衍射定性分析将干燥样品置于日本理学D/MAX-RB型X衍射仪上记录X衍射光谱,并与从虾壳制备的壳聚糖作对比。2讨论2.1壳聚糖的产率将发酵温度分别控制在22、24、26、28、30、32、34℃,转速为200r/min,培养45h后比较壳聚糖产率,结果见表1。从实验结果看,适合于制备壳聚糖最佳温度为28℃。2.2壳聚糖产率测定发酵温度控制在28℃,摇床转速分别取150、175、200、225、250、275、300r/min进行实验,培养45h后比较壳聚糖产率,结果见表2。从实验结果可知,转速大于250r/min,壳聚糖产率趋于稳定,故取转速250r/min。2.3脱乙酰度最佳ph值的确定实验表明,在培养过程中,pH值对生成壳聚糖的脱乙酰度影响较大,可以通过改变pH值来获得脱乙酰度不同的壳聚糖,经过反复实验测得最佳pH值为7.4～7.6。2.4壳聚糖的产率发酵温度控制在28℃,摇床转速为250r/min,培养时间取35h,40h,45h,50h,60h,进行实验,比较壳聚糖产率,结果见表3。实验表明适时收获是个很关键的问题,菌株在培养过程中,壳聚糖的产量和相对分子质量都在变化。培养初期可以发现菌丝体迅速生长,壳聚糖的量也迅速增加。随着培养时间的增加,逐渐达到饱和,菌丝体的量不再增加;另一方面,壳聚糖的相对分子质量随着培养期的延长而迅速下降。实验结果表明,最佳培养时间为45h,此时壳聚糖产率可达15.68%。2.5霉聚糖的稳定性红外谱图比较结果发现由虾壳生产的壳聚糖的峰较多,这说明产品中杂质较多,而用雅致放射毛霉生产的壳聚糖的峰较少,如图1所示,这说明产品中杂质少,很纯净。在1550～1655cm-1处的CN峰比较,虾壳生产的壳聚糖脱乙酰度在60%～70%左右,而且峰是裂峰,而雅致放射毛霉生产的壳聚糖CN峰细长而尖,这证明脱乙酰度好,在85%～90%左右。2.6虾壳聚糖的分离和测定从X衍射谱看,虾壳生产的壳聚糖与丝状真菌生产的壳聚糖略有差别,但其特征峰9°、19°完全一致,这说明从丝状真菌中提取的物质确系壳聚糖,且结构与虾壳壳聚糖相同。3壳聚糖的制备(1)用雅致放射毛霉为原料,通过发酵法制备壳聚糖是可行的。最佳条件是温度为28℃,摇床转速为250r/min,pH值为7.4～7.6,培养时间为45h,壳聚糖产