不同加工工艺对梅花松茸活性多肽的影响

不同加工工艺对梅花松茸活性多肽的影响

鹿毛是一种古老的中国中药。它含有多种生理活性物质，可以促进生长发育和身体体力的发育。国内外专家学者对鹿茸进行了大量研究。传统的热加工提取方法使鹿茸中的热敏感性活性组分损失较大,因此,寻找一种新的鹿茸有效成分的提取方法,将会大大提高鹿茸多肽的提取效率,既节约原材料,又可以保证提取物的高活性。本研究以不同加工方法处理的鹿茸为原料,采用分子排阻层析和离子交换层析的方法提取鹿茸多肽,建立了高效的提取方法,并对提取效果好的产品的免疫功效进行了初步研究,为进一步开发和利用鹿茸奠定了基础。材料和方法1.鲁克斯梅花鹿二杠鲜茸,由中国农业科学院特产研究所鹿茸试验基地提供。2.试验动物SPFBALB/c小鼠,8～10周龄,购自哈尔滨兽医研究所。3.培养基和试剂SephadexG-50和CM-SepharoseFastFlow购自PharmaciaBiotch公司;牛血清白蛋白和MTT购自Sigma公司;蛋白质相对分子质量标准购自中国科学院上海应用化学研究所;其他试剂(均为分析纯)均购自北京化工厂;90-型磁力搅拌器为上海沪西分析仪器厂产品;LB-20切片机为上海科迪仪器有限公司产品;胶体磨为温州轻工设备厂产品;ER-52旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品;HD-3紫外检测仪和DBS-20M电脑部分收集器为上海沪西分析仪器厂产品。4.鹿加工以不同的加工工艺处理鹿茸。4.1冻干、、加工鹿茸留血密封后冷藏运输2h以内,置-80℃冷冻保存,转入冷冻干燥机内进行冻干加工,制成冻干茸。冻干茸在实验室内低温快速粉碎,分装,置-20℃保存。4.2冷冻保存鹿茸留血密封后冷藏运输2h以内,置-80℃冷冻保存。用球磨粉碎机粉碎,加入无菌蒸馏水配制的60%乙醇,经胶体磨研磨成匀浆,冷冻干燥制成茸粉,分装,置-20℃保存。4.3热爆跑鹿茸留血经传统热加工(煮炸、浇炸、烘烤、风干和干燥等)处理,低温快速粉碎,分装,置-20℃保存。5.制备牡丹花松茸的制备分别称取冻干鹿茸粉、冷冻鲜茸和热炸茸粉各200g,用蒸馏水冲洗至无血色后,各加入3000ml预冷的200μmol/LpH3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,用胶体磨匀浆,匀浆过程中不断添加预冷的pH3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液2000ml。将所得的匀浆液于层析柜内放置过夜,7000g离心15min,取上清液,加入无水乙醇至终浓度为60%,4℃层析柜内放置,每20～30min搅拌一次,4h后7000g离心15min,将上清液置50℃水浴中,真空旋转蒸发回收乙醇,最终浓缩体积约为500ml,将其冻干,得梅花鹿鹿茸粗提物,-18℃保存备用。以上操作除减压回收乙醇外,均在4℃低温条件下进行。6.冷却、干燥、称重分别称取冻干鹿茸粉、冷冻鲜茸和热炸茸粗提物各10g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5mm,精密称量。打开瓶盖,于100～105℃干燥5h,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30min,精密称量重量。再于100～105℃干燥1h,冷却,称重,至连续2次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量,计算各样品中的水分含量。7.蛋白浓度测定采用Lowry法。以牛血清白蛋白为标准品,精密定容,梯度稀释,在270nm处测吸光度值,绘制标准曲线,由标准曲线求得各样品蛋白浓度。8.纯度试验采用SDS系统检测粗提产物的纯度。9.去离子水平衡层析柱的安装称取10gSephadexG-50,分别浸泡在200ml重蒸水中,充分溶胀,倾去漂浮的细颗粒,再将SephadexG-50分装入处理好的层析柱,用5倍柱体积以上的去离子水平衡层析柱。取上述粗提物含量高的冻干鹿茸的冻干品1.0g,溶解于5ml去离子水中,用0.45μm膜过滤除去杂质,将样品加入柱内(上样量为150mg/ml,5ml),用去离子水洗脱,洗脱液流速1.0ml/min,紫外检测仪280nm检测活性峰,部分收集器收集活性峰处液体,-18℃分别保存备用,MTT法检测多肽活性,Lowry法检测蛋白含量。10.洗脱和活性检测分别取活性峰收集液100ml,以醋酸-醋酸钠缓冲溶液调整pH值和离子强度至pH值3.5,以CM-SepharoseFastFlow为介质装填层析柱,层析柱充分平衡后,以1.5ml/min流速将样品注入柱内,加样后以10ml/min流速,分别用5mmol/LpH3.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液和0.5mol/LpH4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱,紫外检测仪280nm检测活性峰,部分收集器收集活性峰,透析除盐冻干,-18℃保存备用,MTT法检测多肽活性,Lowry法检测蛋白含量,还原型SDS分析纯度。11.pap组的筛选取BALB/c小鼠20只,随机分为2组,每组10只,即空白对照组和PAP组(从上述3种提取方法中选取蛋白纯度、含量高的1组作为PAP组)。空白对照组每日腹腔注射生理盐水1次,PAP组每日腹腔注射PAP1次(按10ml/kg体重计算,浓度为40mg/ml),连续20d。12.免疫活动的检测12.1对小鼠脾细胞增殖的影响小鼠引颈处死,75%乙醇消毒,无菌条件下取出脾脏,经200目筛网和淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC),按常规方法制备小鼠脾细胞悬液,用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至2×106个/ml,分种96孔板,每孔200μl,每次做3个重复孔,37℃,5%CO2全湿润培养68～72h,以MTT法检测细胞增殖情况。每隔7d测1次,并计算刺激指数。刺激指数SI=实验孔A/对照孔A。12.2低通插装细胞悬液的制备试验前3d,腹腔注射1ml4%可溶性淀粉肉汤,3d后引颈处死小鼠,75%乙醇消毒,以冷灌洗液灌洗腹腔,收集腹腔渗出细胞悬液,用冷的RPMI1640培养基洗2次,再以完全培养基重悬,调整细胞浓度至2×106个/ml,分种24孔培养板,37℃,5%CO2全湿润培养3h,弃去未贴壁细胞,以37℃预温的RPMI1640培养基洗2次,再以完全培养基重悬,即得巨噬细胞悬液。用小鼠IL-12p40ELISA试剂盒(BD)检测小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-12的水平。结果1.相对分子质量检测结果表明,冻干鹿茸的含水量最低;可溶性多肽和蛋白含量最高,分别是冷冻鲜茸的9.48和7.08倍,是热炸茸的14.20和8.36倍,见表1。从SDS图可见,冻干鹿茸抽提液蛋白带浓度高,相对分子质量分布广,在相对分子质量50000～60000之间有一条粗而浓的电泳带。相比之下,冷冻鲜茸、热炸茸抽提液的电泳带浓度和数量明显减少,均在相对分子质量50000～60000之间有一条电泳带,热炸茸浓度最高的蛋白电泳带在相对分子质量十几万处,见图1。表明冻干鹿茸的可溶性多肽提取效果最好。2.mtt法检测分离质中各多肽峰的活性将冻干鹿茸粗提物的冻干品经SephadexG-50分子排阻层析,洗脱图谱见图2,得到组分为A、B、C的3个多肽峰,MTT法检测结果表明,组分B的活性较强,组分A、C的活性较弱。收集组分B并冻干,冻干品呈白色粉末状,易溶于水,其蛋白含量为21.3mg/ml。3.mtt法检测分离分离中分离的活性成分将SephadexG-50分子排阻层析得到的组分B经调整pH值及离子强度后,再经CM-SepharoseFastFlow柱层析,洗脱图谱见图3,得到组分B1和B2,MTT法检测结果表明,组分B2的生物活性较强,B1的活性较弱,收集组分B2并冻干,冻干品呈白色粉末状,易溶于水,其蛋白含量为82.8mg/ml。4.ef过滤层析分离SephadexG-50柱层析和CM-SepharoseFastFlow层析分离纯化得到的多肽,经还原型SDS检测,显示为单一条带,表明分离得到的鹿茸多肽纯度较高。经计算,PAP的相对分子质量为3200,见图4。5.免疫活动的检测5.1app对大鼠t和b细胞的克隆影响PAP组SI值均比对照组高,差异均有显著意义(t≥1.645,P<0.05),表明PAP能明显增强T、B淋巴细胞的增殖反应,见表2。5.2pap刺激腹部肝细胞产生il-12等级经检测,PAP能明显刺激腹腔巨噬细胞产生IL-12,与对照组相比差异有显著意义(t≥1.96,P<0.05),见表3。含纺加工对材料的提取对鹿茸的研究均证实鹿茸具有强大的生理功效,但对其药理机制的研究尚处于初级阶段。鹿茸的促生长、促代谢、抗炎、免疫调节、健脑益智、抗衰老、生血、促进伤口及骨折愈合的药理作用是目前已知化学成分所无法解释的。这一方面是因为鹿茸是所有哺乳动物中生长最迅速的可再生器官,在90d内能迅速生长发育成骨、血管、表皮、毛发和神经等俱全综合器官。这实际上是在大量细胞生长因子调控下进行的细胞生长和分化过程。因此,鹿茸富含调控上述各器官组织发育成长的各类细胞生长因子,是一个高浓度多种类的天然细胞生长因子库。另一方面,鹿茸的加工方法对其成分的收集有很大影响。传统的加工方法是热加工,其目的是使鹿茸脱水干燥,防腐消毒并最大限度保持其有效成分,使其既便于保存,又不影响疗效。但这种加工方法会破坏鹿茸里所含有的活性肽、酶类以及细胞因子。虽然近几年加工方法有所改进,如采用水煮-远红外线加工、双电子自控远红外箱技术加工等,但仍以热加工为基础。目前多数对鹿茸的化学、药理研究的报告中所用的鹿茸均为热加工饮片提取物(包括醇及其他有机溶酶提取),因此大部分不耐热的活性成分被忽略,而所用的分离提取方法、条件及溶媒(常用有机相)也不能发现大分子活性物质,代表鹿茸药理及临床效果的主要成分依然不清,使得鹿茸药理研究处于停滞不前的状况。研究开发冷冻干燥鹿茸粉提取工艺,可为分离提取鹿茸中活性物质并进一步研究鹿茸的药理和临床应用提供原料保证。本实验采用的低温提取环境,尽可能降低了鹿茸中活性物质的损失,提高了提取物中有效成分的含量。国内外学者相继报道在鹿茸中发现各种细胞生长因子。Suttie等、江润祥等发现具有调节软骨组织生长的胰岛素样生长因子;Gray等、Huo等分离得到具有刺激神经纤维生长活性的神经生长因子;Garcia等研究神经营养因子基因;江润祥等分离使上皮细胞增生的