n端氨基酸序列测序研究进展

n端氨基酸序列测序研究进展

氨基酸序列的测定是了解蛋白质性质和功能的重要路径。氮和氨基酸是重要的结构和功能部位。序列具有很高的特异性。我们可以通过在n端少数氨基酸残基中测定某些氨基酸。例如,可以通过对蛋白质和多肽类药物的N端进行人工修饰(如环化修饰、甲基化修饰等),提高其降解稳定性延长药效。因此N端肽段的鉴定具有非常重要的意义,本文对近年来蛋白质和多肽N端测序技术及方法进行了综述。1核心组蛋白的td-4/d定位与操作所有蛋白质合成都起始于N端,其序列组成对其生物学功能有着巨大的影响。(1)蛋白质的半衰期与N端氨基酸的特异性有关,或者说N端氨基酸残基对蛋白质的寿命有控制作用;(2)N端序列与蛋白质的亚细胞器定位有密切关系,例如,某些特殊的氨基酸序列可以作为蛋白质分选标记影响蛋白质定位;(3)蛋白质的N端可发生许多种翻译后修饰,影响其结构和功能。如在新生肽链的成熟过程中,2/3的叶绿体蛋白质会发生起始甲硫氨酸残基的剪切和前导肽的去除;又如核心组蛋白N端赖氨酸的可逆乙酰化修饰使组蛋白与DNA间的作用减弱,导致染色体局部解旋,促进基因转录,而去乙酰化则抑制基因转录。这种乙酰化和去乙酰化过程中的任何异常都会导致生长、发育的紊乱,诱发白血病、皮肤癌等疾病。因此,通过对蛋白质N端序列的研究有利于分析蛋白质的高级结构,揭示蛋白质的生物学功能。2蛋白质和茶多酚n端测量技术2.1edan降解1955年,FrederickSanger采用二硝基氟苯(FDNB)法,首次成功地完成了第一个蛋白质——牛胰岛素的序列分析。在此测序方法的基础上,瑞典有机化学家Edman提出了蛋白质N端顺序测定方法——Edman降解。之后随着基于此原理的液相、固相及气相自动蛋白质序列分析仪的推出和逐步完善,经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白质的N端测序。Chen等在微流控芯片上进行Edman反应,使得肽段测序的灵敏度提高到亚飞摩尔水平;并利用Edman反应2次循环得到肽段的串联质谱(MS/MS)图的b2离子为内标,获得了更好的二级质量准确度,实现了肽段快速、可靠的测序。但Edman降解方法受到以下诸多限制:(1)用于序列分析的蛋白质或多肽必须是高纯度的;(2)N端封闭的蛋白质难以进行Edman反应,虽然出现了一些去除N端封闭基团的方法,例如用蛋白酶去除N端焦谷氨酸和通过酸催化的亲核取代去除N乙酰化丝氨酸和N乙酰化苏氨酸残基等,但都只适于一定残基的特定修饰,没有普遍适用性,且许多末端残基修饰是无法移去的;(3)不适于高通量分析,灵敏度不够。但是Edman降解对于整体纯化的蛋白的N端序列分析仍是很有价值的研究工具。人们还利用RT-PCR从编码蛋白质的mRNA得到其cDNA序列,再根据遗传密码表反推出其相应的氨基酸序列。20世纪80年代出现了从基因组中找出编码蛋白质的基因,测定其DNA序列,再反推出蛋白质的氨基酸序列的技术。其特点是更加简便、快速,但利用RT-PCR或测定基因组的碱基序列也不能完全描述蛋白质的一级结构,它对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能为力。2.2激光解吸放电-飞行时间技术的应用质谱(MS),尤其是电喷雾(electrasprayionization,ESI)和基质辅助激光解吸电离-飞行时间(matrix-assistedlaserddesorption/ionizationtime-of-fight,MALDI-TOF)的出现,使质谱技术在蛋白质结构分析中的应用发生了革命性的飞跃。高灵敏度、高准确性、高分辨率和高通量的生物质谱技术为蛋白质的N端测序提供了一种重要的选择。2.2.1氨基酸序列的确定是间接肽序列测定技术,通过末端酶解或化学降解产生一组相互之间仅差一个氨基酸残基的多肽系列,经MALDI-TOFMS鉴定后,根据所得到的肽阶梯图中各肽段的相对分子质量差值确定末端的氨基酸序列,从而用于数据库查询。阶梯测序是最早探索用质谱进行蛋白质测序的例子,经过几个Edman反应循环的肽段混合物被MALDIMS检测,原始肽段的序列就可从质谱测得的梯形序列里得到阐明。另外,Zhong等还提出了质谱结合微波辅助酸水解的阶梯式测序方法,通过25%的三氟乙酸溶解蛋白质,用普通微波辐射10min后,用质谱直接检测其酸水解的梯度产物进行蛋白质序列的分析。2.2.2磺酸基修饰n端肽许多对末端肽的研究方法采用的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合,通过N端的各种化学标记,运用MS/MS或多级质谱(MSn)的碰撞诱导裂解(collisioninduceddissociation,CID)、源后裂解(post-sourcedecay,PSD)等碎裂技术测序,或标记的N端肽段先经过选择性的分离,再进行从头测序。Noga等通过N端肽的乙酰化/氘代乙酰化的1:1修饰,运用快原子轰击(fastatombombardment,FAB)质谱进行标记N端肽的鉴定。Keough等首先发现,通过在酶切肽段的N端引入带一个单位负电荷的磺酸基,有利于肽段的从头测序。这种酰化修饰可以促进肽链酰胺键在MALDI源质谱中的断裂并抑制N端碎片离子的生成,产生连续的y离子系列。本实验室曾通过邻磺基苯甲酸环酐对蛋白质的N端肽进行磺酸化修饰,使其在一级负离子模式下成为便于识别的基峰,并通过MALDIMS的PSD二级质谱分析,形成连续的y离子系列碎片,实现了对N端肽序列的测定。Yamaguchi等将蛋白质经过还原、烷基化和侧链氨基的胍基化封闭,用不同的生物素类试剂标记自由的N端,标记后的蛋白质经胰蛋白酶酶切后,通过抗生物素亲和体系将标记的N端肽分离出来,再通过MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSDMS从头测序,获得了N端肽的序列。Gevaert等提出对角线色谱法(combinedfractionaldiagonalchromatography,COFRADIC)进行N端肽的研究,利用肽段在末端氨基的2,4,6-三硝基氟苯修饰前、后在反相色谱上的色谱行为的差异定位N端肽,从人血小板的细胞质和膜骨骼蛋白质组分中鉴定出305个N端肽,此法还应用于嗜盐菌的N端肽分析。N端肽的化学修饰除了便于其检测,还被尝试用于蛋白质的相对定量研究。如通过合成磺苯基异硫氰酸(SPTIC)的稳定同位素类试剂13C-SPITC,与常规的12C-SPITC试剂一起进行蛋白质标记,不仅有利于肽段从头测序,而且无论使用MALDI-TOF/TOF还是RPLC-ESI-MS/MS,对标准蛋白的相对定量都得到了理想的效果。Hsu等利用对N端肽的双甲基化标记,大大提高了衍生肽段在二级质谱中的a1离子信号。他们将这种在非衍生化肽段中很难被检测到的a1离子作为N端氨基酸的质量标签,增加了肽段从头测序和数据库检索的可靠性,并以血红蛋白为例考查了用于蛋白质相对定量的可行性。目前上述方法大多还处在在简单体系中探索的阶段,只有少数已应用于蛋白质组的N端分析,操作也很繁琐;N末端天然封闭的蛋白质测序的方法还需要进一步改进。2.2.3封闭n端肽的分离与maldi-tof-ms鉴定蛋白质的N端常常发生甲基化、乙酰化、焦谷氨酸环化等各种修饰。各种修饰使得N端被封闭,无法进行直接的Edman降解测序,也无法结合化学修饰进行质谱鉴定。且去除N端封闭基团的方法都不具普遍适用性。如何将这种封闭的N端肽从大量自由N端肽段中分离出来,降低肽段混合物的复杂程度,提高N端肽质谱鉴定的机会,对蛋白质末端信息的获得和分析十分重要。Gorman等最早提出使用离子交换色谱,利用封闭N端肽与中间肽段的碱性不同,分离鉴定了病毒蛋白质的N端肽。Dormeyer等报道了一种迭代数据库搜索策略,对来自人胚胎癌细胞粗膜的肽段的强阳离子交换色谱(SCX)馏分进行末端肽的目标分析发现,鉴定到的非冗余N乙酰化肽段中,超过80%在10min内被低盐流动相从SCX色谱柱上洗脱,表明SCX技术在一定程度上可用于蛋白质N端肽的分离。最近,Coussot等使用金属内切蛋白酶Lys-N,利用异硫氰酸苯酯修饰的玻璃珠共价结合中间肽,实现了碳酸酐酶封闭N端肽的分离和MALDI-TOFMS鉴定,这种反应有较好的特异性,但所用金属内切酶Lys-N的酶切作用过于温和,一些位点可能不会被切开,不利于MALDIMS的检测。Toshiyuki等最近也报道了用异氰酸基团来修饰树脂,通过控制弱酸性反应条件去除胰蛋白酶酶切后所有自由氨基端的肽段,很好地实现了封闭N端肽的分离及MALDIMS鉴定。这些新方法通过去除自由N端肽段,减少了体系的复杂程度,对N端肽的鉴定有着潜在的应用价值。3蛋白质n端测序技术的展望综上所述,蛋白质和多肽的N端序列分析,随着经典方法、基于质谱的各种化学修饰以及酶法辅助技术不断地发展和完善,获得了丰富的末端肽序列信息,为蛋白质的准确鉴定提供了有力的依据,并加深了我们对蛋白质的结构和功能的理解。但目前现有的数据库仅提供了少量甚