淀粉样多肽诱导阿尔兹海默症的研究进展

淀粉样多肽诱导阿尔兹海默症的研究进展

阿尔茨海默综合征（ad）是最常见的老年人疾病，于1906年首次报告。其临床表现为认知功能退化,记忆力和学习能力降低,最终丧失自主生活能力。随着我国人口老龄化程度的加剧,阿尔兹海默症已经成为了我国国民重要的健康隐患。目前对于阿尔兹海默症尚无有效的早期诊断手段和治疗方法,已发现的病理特征为神经元内部的神经缠结和细胞外的淀粉样斑块。神经纤维缠结是由一种微管结合蛋白(tau蛋白)因过磷酸化从微管上脱离并且自聚集成为纤维状蛋白所导致的。此聚集容易造成神经元细胞骨架崩解,进而引发神经炎症,同时聚集的纤维在细胞内堆积会造成神经信号通路的敏感性降低。淀粉样斑块是由β淀粉样多肽(amyloid-β,Aβ)在大脑的海马区及皮层发生沉积(聚集)造成的,Aβ是一段长度为40多个氨基酸的多肽,由其前体——淀粉样蛋白前体(amyloidprecusorprotein,APP)水解得到。APP是一个一次跨膜蛋白,其N端暴露在细胞外,在β分泌酶(β-secretase,又称betasiteAPPcleavingenzyme,BACE1)和γ分泌酶(γ-secretase)的共同切割下可以得到完整的Aβ蛋白,如图1所示。由于切割位点的多样性,得到的蛋白会含有不同数量的氨基酸残基,在人体内含量较多的Aβ形式是含有40个氨基酸的Aβ1-40(Aβ40)和含有42个氨基酸的Aβ1-42(Aβ42)。目前的研究进展表明,Aβ蛋白的聚集在阿尔兹海默症的发病过程中有着重要的作用,是最重要的致病因素之一;而且,在神经系统中有着关键生理作用的朊蛋白在Aβ诱发阿尔兹海默症的过程中有着重要的调控作用;因此,笔者旨在讨论朊蛋白在阿尔兹海默症的发病过程中所起到的复杂作用,同时对多种复杂关系进行分析,对以朊蛋白为靶点的治疗手段进行了预测。1由于a'的遗传过程和氨基酸磷的生理功能1.1对细胞毒性和神经系统退行如图2所示,在Aβ的聚集过程中,通常会经过2种状态,首先形成球状的可溶性寡聚体,寡聚体再进一步形成纤维丝状结构沉淀在细胞膜表面。从单体到寡聚体再到纤维丝要经历不同的构象,通常Aβ蛋白形成纤维丝时会呈现出大量的反向平行的β折叠结构,此结构对于细胞膜会有伤害并引发细胞凋亡。然而,有研究表明,在Aβ聚集的过程之中,寡聚体往往具有更大的毒性。实验证明将寡聚体注射到小鼠脑内会造成小鼠的学习记忆能力降低,大量细胞实验也证明寡聚体对于细胞具有更大的毒性,甚至有研究表明tau蛋白的过磷酸化也可能是由于Aβ寡聚体造成的。目前,普遍认为Aβ寡聚体通过两种方式造成细胞毒性和神经系统退行:一方面是Aβ寡聚体能够附着于细胞膜上从而改变细胞膜通透性。有实验表明,Aβ蛋白形成的寡聚体在膜环境下,往往倾向于形成α螺旋的构象,这一构象容易插入磷脂膜内形成跨膜蛋白。计算研究发现多个这样的跨膜单位能够组成跨膜通道,进而使得膜内外的水分子和离子的通透性大大增加,最终由于渗透压的改变导致细胞膜的崩解和神经元的凋亡。在体外的模拟实验中,也观察到Aβ蛋白能够改变磷脂脂质体的离子通透性。另一方面,Aβ寡聚体能够与受体结合,介导细胞凋亡和细胞炎症的相关通路。即Aβ蛋白寡聚体不直接与磷脂膜作用时,而是作为信号分子或信号分子的抑制剂与细胞膜表面的Aβ受体结合,导致细胞内异常通路的激活或者正常通路的抑制[30。由于生物信号具有很大的扩增作用,在发病过程中这种效应往往能够发生更大的效用。在目前的研究中,被发现的受体分子有胰岛素受体等。不同的受体会有不同的功能,其中朊蛋白是较为特殊的一种受体。1.2蛋白基因对神经的影响朊蛋白是动物体内一种高度保守的蛋白,在神经系统中有较高的表达。成熟的朊蛋白包含209个氨基酸残基并有较为复杂的糖基化修饰,它的C端通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜的脂筏上,并暴露在细胞膜外侧。游离的朊蛋白容易与糖基化磷脂酰肌醇结合并定位在脂筏上。在其N端有若干个八肽重复序列,据报道和铜离子有较好的结合能力。虽然错误折叠的朊蛋白会引发疯牛病、羊搔痒症等很多传染性神经退行疾病,但是正常的朊蛋白(也称细胞型朊蛋白,cellularprionprotein,prpc)在神经系统中有着较为重要的功能。目前发现敲除了朊蛋白基因核心区段的小鼠在低龄期已发生神经退行,而敲除不同区段的朊蛋白基因会对神经系统有不同的影响,说明其对于神经发育有着较为重要而复杂的作用。同时,朊蛋白在神经系统中还有调节细胞膜内外氧化压力以及离子平衡的作用,是神经系统中表达量较高而且较为重要的一种蛋白。2信号分子受体目前对于朊蛋白在阿尔兹海默症的发病过程中的影响主要有两种观点:其一认为朊蛋白作为膜锚定蛋白能够起到信号分子受体的作用,通过与细胞外的Aβ寡聚体结合引发细胞内的通路而产生毒性;另一观点认为朊蛋白能够影响Aβ的生成从而起到神经保护作用。实际上,由于朊蛋白本身结构特点以及糖基化修饰的复杂性导致了其本身具有多种功能,此二种功能可能在体内同时存在并且均发挥一定的作用。2.1蛋白化合物引起的神经毒性2.1.1诱导细胞毒性Lauren等在2009年的报道称,敲除了朊蛋白基因的细胞系对于Aβ寡聚体介导的神经毒性不敏感。Bate等发现向敲除朊蛋白基因的细胞的培养基中加入游离的朊蛋白时,Aβ寡聚体对细胞的毒性会随着加入的朊蛋白量的增加而逐渐恢复敏感性,说明很有可能Aβ蛋白寡聚体诱发细胞毒性的过程中需要朊蛋白介导。且AlunWilliams课题组还发现,朊蛋白的表达量并没有影响Aβ蛋白的聚集程度。后来陆续发现,朊蛋白能够介导Aβ引起多种生理反应,包括电位失常、突触损伤、跨膜物质运输效率降低甚至细胞凋亡等。在体外利用Aβ蛋白寡聚体和朊蛋白的实验证据表明,Aβ蛋白寡聚体和细胞膜上的朊蛋白能够直接结合,而此结合是细胞毒性产生的原因。Lauren、Freir等利用朊蛋白的单克隆抗体与两种蛋白的结合位点相互作用而阻断朊蛋白和Aβ寡聚体的结合,发现神经毒性也随之消失。Freir等还在体外利用免疫学实验证明二者之间的结合具有特异性,而且结合位点位于朊蛋白的91~119位氨基酸之间。Lauren也发现95~110位氨基酸是朊蛋白和Aβ42蛋白的结合位点,敲除这些位点或者利用单克隆抗体与这一位点结合后,细胞对于Aβ寡聚体所诱导的毒性再次显示出不敏感性。Bate和Freir等通过实验和计算中发现,朊蛋白往往以2︰1甚至更高的比例和Aβ蛋白寡聚体相结合,与多个朊蛋白结合使得Aβ寡聚体与细胞膜表面的朊蛋白集合更牢固。而且有报道表明,Aβ蛋白寡聚体能够使得细胞膜表面的朊蛋白增加并富集在Aβ寡聚体周围。因此,由于朊蛋白暴露在细胞膜外,Aβ蛋白寡聚体可能通过与朊蛋白结合导致其引发细胞膜内的代谢异常;同时,由于朊蛋白在神经系统中具有重要的生理功能,Aβ寡聚体与大量的朊蛋白结合后会造成朊蛋白正常的功能紊乱;因此可以推测朊蛋白在Aβ寡聚体诱导神经毒性的过程中有着重要的作用。2.1.2蛋白诱导a寡聚体的细胞磷脂酶激活和激活在研究朊蛋白介导的Aβ蛋白寡聚体诱发神经毒性的过程中,可以通过对细胞内各种功能物质和反应的变化来确定朊蛋白受体引发的细胞内反应。2009年Bate等发现细胞中突触泡蛋白的量会随着外源朊蛋白加入量的增加而减少,而细胞内被激活的细胞磷脂酶(cellularphosphalipaseA2,cPLA2)会随之增加。由于突触泡蛋白是跨膜蛋白,细胞膜的损伤会造成膜蛋白脱落,因而细胞膜的损伤显然是由于细胞磷脂酶的激活引起的。细胞磷脂酶被激活之后,能够使得细胞膜崩解、突触退化、运输能力降低以及突触膜蛋白脱落等一系列神经损伤。因此,根据AlunWilliams小组的工作,朊蛋白介导Aβ蛋白诱导神经毒性的机理很可能是其激活了细胞磷脂酶。虽然朊蛋白不是跨膜蛋白,但是其依然能够传递生物信号,这很可能是因为朊蛋白锚定在细胞膜的脂筏区,而脂筏是细胞膜功能特异性的区域,在此区域朊蛋白和Aβ蛋白寡聚体的结合或许会影响细胞正常的生理代谢功能。Bate等在离心细胞裂解物时发现激活的细胞磷脂酶主要出现在脂筏所存在的组分中,说明细胞磷脂酶转移到了脂筏上并且很可能定位到朊蛋白附近;而从细胞裂解物中分离出脂筏后,利用免疫化学方法能够确定该组分中有Aβ蛋白寡聚体、朊蛋白和细胞磷脂酶的共同存在。这说明在Aβ蛋白寡聚体与朊蛋白相结合的时候,会使激活的细胞磷脂酶转移到脂筏上,而此时激活的细胞磷脂酶在细胞膜附近时会对其造成伤害。但如果在细胞裂解物中加入能使脂筏崩解的表面活性剂,则离心之后无法得到3种蛋白的共聚物,说明了这三者并非直接作用,而是依赖于脂筏这一复杂的多功能结构相结合。Bate还通过分析朊蛋白和Aβ寡聚体的复合物发现,在此诱导毒性的过程中,Aβ蛋白的寡聚体与朊蛋白以1︰2的比例结合,若使用有两个朊蛋白表位单克隆抗体与细胞直接作用时,发现细胞毒性和细胞磷脂酶的激活与Aβ寡聚体的作用结果相同。这说明Aβ寡聚体很可能并不是必需的,而只需要两个朊蛋白分子互相靠近即可。因此推测朊蛋白介导Aβ寡聚体的细胞毒性的作用机理有可能是Aβ寡聚体其导致细胞膜表面的朊蛋白的二聚化或相互靠近所导致的,如图3所示。因此,朊蛋白介导Aβ寡聚体毒性的关键是二者在脂筏区的结合以及随后诱导的细胞磷脂酶的激活和定位。Bate等利用抑制剂抑制细胞磷脂酶的作用后,发现朊蛋白介导Aβ寡聚体诱发神经毒性的能力也消失了。结合Lauren和Freir等利用单克隆抗体的方法,可知朊蛋白和Aβ寡聚体的结合以及细胞磷脂酶的激活是AD发病过程中的重要步骤,同时也应是治疗AD的重要靶点。2.2蛋白的表达程度虽然大量的数据发现朊蛋白是Aβ产生毒性的重要因素,但是同样有报道发现朊蛋白的表达程度的增加,Aβ蛋白的产生量会有所降低,即朊蛋白能够减少Aβ的产生,从而有一定的神经保护作用。2.2.1蛋白表达程度的影响由于朊蛋白在自身序列、糖基修饰以及生理功能上都有一定的复杂性和特殊性,因此其在神经退行性疾病中的作用也较为复杂。在不同实验条件下,有时也会发现朊蛋白不具有介导Aβ蛋白寡聚体毒性的功能,甚至在阿尔兹海默症的发病过程中有一定的神经保护功能。Parkin等利用朊蛋白表达程度不同的细胞实验发现,随着朊蛋白的表达程度的增加,细胞所产生的Aβ蛋白的量会有所减少,当干扰朊蛋白的表达后,Aβ蛋白的生成又会增加。由于发现APP蛋白的表达量并没有减少,而由β分泌酶单独切割APP蛋白所产生的sAPPβ的量也会减少,可以推测知道朊蛋白具有抑制β分泌酶的作用效果。2.2.2蛋白c端与糖基化为蛋白的运输目Parkin等利用人工重组质粒的方法分析了在这一保护作用中起作用的朊蛋白片段,他在朊蛋白基因上的不同区段进行突变后,分析了突变体对于细胞分泌Aβ的影响,最终发现朊蛋白完整的N端和C端是起到这一保护作用的关键,如果此二片段被敲除或替换,则朊蛋白不再能够减少Aβ的分泌。正常的朊蛋白C端上有和糖基化磷脂酰肌醇的连接位点。如果将C端与糖基化磷脂酰肌醇结合的位点突变成跨膜单位时,即使朊蛋白能够固定在细胞膜上,也无法行使神经保护作用,这说明朊蛋白的保护作用的发挥依赖于其定位于脂筏上。而正常朊蛋白的N段具有复杂的糖基化修饰,若用肝素将N端糖基上的活性位点占据或者敲掉N端糖基化的肽段,其也无法行使神经保护作用。因此可以推测,朊蛋白上N端修饰的氨基葡聚糖很可能是发挥作用的活性位点。为了进一步研究朊蛋白对于β分泌酶的抑制机理,Hooper课题组在表达朊蛋白的细胞的培养基中加入β分泌酶,利用朊蛋白抗体进行免疫共沉淀实验,发现朊蛋白能够特异性结合β分泌酶,而此结合又能够被肝素可逆地阻断。由此可知β分泌酶与朊蛋白N段的糖基有很好的结合作用。由于朊蛋白在细胞膜表面的分布局限于脂筏上,因此在与朊蛋白上的糖基相结合之后,β分泌酶行使切割作用范围在空间上就大大缩小了。最终Aβ蛋白的分泌量降低,对神经元的损伤也就降低了。2.2.3蛋白的保护作用目前对于朊蛋白在阿尔兹海默症中的两种作用均已被证明存在。实际上,由于朊蛋白的结构和后修饰的复杂性,其生理功能具有多重性和复杂性也不难理解。深入分析以上两种不同影响的机理可以发现,朊蛋白的有害作用主要是100位氨基酸附近的氨基酸残基发挥的作用,该位点和Aβ蛋白寡聚体的直接结合导致了朊蛋白的分布变化从而导致细胞内细胞磷脂酶的激活;而其保护作用主要是通过朊蛋白上修饰的糖基完成,糖基和β-分泌酶的结合导致了对后者作用的抑制。即朊蛋白的不同区域发挥着不同的生理功能。由于Williams课题组控制朊蛋白的量的方式是向敲除了朊蛋白基因的细胞培养基中加入游离的朊蛋白,虽然朊蛋白能够自发地与糖基化磷脂酰肌醇结合并被后者锚定在脂筏上,但是缺乏正常的细胞内蛋白质修饰,某些糖基上的位点的作用可能没有被发现,可能因此只发现了朊蛋白的毒性作用。在其他的实验中,Lauren等通过转染的方式控制朊蛋白的表达,依然发现了完整修饰的朊蛋白有介导细胞毒性的作用,而Parkin也只发现了朊蛋白能够导致Aβ蛋白的减少,并没有发现此作用可以降低细胞毒性,由此推测,这两种作用中,朊蛋白的介导细胞毒性的作用占主导。实际上,Aβ和朊蛋白能够相互调控,APP被切割分泌后的残基(AICD)能够加强朊蛋白的表达,而朊蛋白反馈减弱APP的切割,这种调节使得