广西甜茶制剂中甜茶素的测定

广西甜茶制剂中甜茶素的测定

广西甜茶是蔷薇科的一种多年生类型的悬钩子。这些叶子和树枝是广西特有的野生甜植物，具有低能量，高甜味，具有独特的经济功能。主要成分为萜类、黄酮、多酚、氨基酸及矿物质等。广西甜茶在民间有悠久的应用历史,长期以来除当茶叶饮用之外还可入药,具有清热、润肺、祛痰、止咳等功效,并用于糖尿病和高血压病等症的辅助治疗。现代药理学研究表明广西甜茶还具有减肥和抗肿瘤的作用。甜茶素,又称甜叶悬钩子苷,甜度相当于蔗糖的300倍,是广西甜茶甜味构成的主要成分。药理研究表明,甜茶素具有降血糖、降血脂、降血压等药理活性,与广西甜茶的主要功效一致。甜茶素是由斯替维醇和葡萄糖结合而成的四环二萜苷,分子式C32H50O13,化学结构见图1。目前市面销售广西甜茶的制剂以袋泡茶为主,国内主要产区是在广西,国外是在日本。研究表明,甜茶中甜茶素的含量可因不同的产地、采收季节、采收部位而有较大差异,制剂中甜茶原材料的来源也可能受这些因素的影响而导致制剂中甜茶素的含量差异。文献报道采用分光光度法、红外光谱法、高效液相色谱法等对甜茶药材中甜茶素含量进行测定。但分光光度法需要经过对甜茶素水解、显色、薄层分离后进行紫外分析等繁杂的步骤;红外光谱法能区别甜茶素的含量差异但无法定量;高效液相色谱法虽然作为目前含量测定最常用的方法,但与基于小粒径填料色谱柱技术的RSLC相比较,仍存在分析时间长、溶剂消耗量大、分离效能较低等缺点。因此本文首次采用RSLC-DAD对市场上销售的广西甜茶制剂中甜茶素含量进行快速测定并进行比较,该方法可以显著缩短分析时间和节省有机溶剂,为建立科学合理的广西甜茶袋泡茶质量标准提供依据。1仪器和试剂盒1.1动进样器和dad-400rs检测戴安Ultimate3000超快速液相色谱仪(包含3000RS泵,WPS-3000RS自动进样器,TCC-3000RS柱温箱,DAD-3000RS检测器,变色龙色谱数据处理软件,美国DIONEX);CP225D电子分析天平(德国SARTORIUS);Milli-Q超纯水系统(美国MILLIPORE);SB-5200D超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。1.2广西甜茶制剂样品甜茶素对照品(03-1001,上海中药标准化研究中心);广西甜茶制剂样品(市售,共21份,见“2.9”项下);乙腈(色谱纯,Fisher);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.1回收塔板分离度色谱柱为DionexRSLC120C18柱(50mm×2.1mm,2.2μm),流动相为乙腈-水(36∶64),检测波长205nm,柱温40℃,流速0.3ml/min,进样量2μl。按甜茶素峰计算理论塔板数不低于2000,分离度大于1.5。色谱图见图2~3。2.2对照品贮备液的制备精密称取甜茶素对照品10.0mg置10ml量瓶中,加50%乙醇超声溶解后定容,配成浓度为1.00mg/ml的对照品贮备液。精密吸取储备液3ml置5ml量瓶中,加50%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.60mg/ml对照品工作液,精密吸取该工作液1ml置10ml量瓶中,50%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为60μg/ml的对照品工作液。2.3rslc分析法提取样品精密称取甜茶粗粉(糖果碾碎后称取)0.05g,置2ml的量瓶中,加入2ml的50%乙醇,超声提取15min,放冷至室温,用溶剂定容至刻度,摇匀,取提取溶液过0.22μm微孔滤膜,取续滤液即得RSLC分析样品。2.4方法的线性范围与峰面积线性关系取甜茶素对照品工作液,用50%乙醇稀释成系列浓度(15,30,90,150,210,300μg/ml),每个浓度进样3次,以平均峰面积(A)为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,做线性回归,计算得回归方程为Y=19.099X+0.0997,r2=0.9997,表明甜茶素进样量在0.03~0.6μg范围内与峰面积呈良好线性关系。2.5仪器精密度试验精密吸取同一供试品溶液(0018),按上述色谱条件,连续进样5次,测得甜茶素平均峰面积为8.5894,RSD=1.9%,表明仪器精密度良好。2.6稳定性测定方法取同一份样品(0018),分别在0,2,4,6,8,10,12h进样分析,测定样品在12h内的稳定性。结果峰面积RSD为1.3%,表明甜茶样品在12h内稳定。2.7测定甜茶素含量精密称取同供试品(0018)5份,按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液,测定甜茶素的含量。结果甜茶素平均含量为45.17mg/g,RSD=1.3%,表明方法重复性良好。2.8对照品回收率试验精密称取已知含量的样品(0018),平行9份,分别加入对照品适量(约为样品中甜茶素含量的50%,100%,150%,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,进样测定,计算各样品的对照品加样回收率。结果平均回收率为99.1%,RSD为0.97%,符合含量测定要求。2.9甜茶样品测试按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按色谱条件测定峰面积,以标准曲线计算甜茶素含量。结果见表2。3讨论3.1高效液相色谱法本实验首次建立了RSLC-DAD对不同厂家的广西甜茶制剂中甜茶素的测定方法。RSLC是一种分析速度快、灵敏度高的新色谱技术,与传统HPLC相比具有分离度高、速度快、灵敏度高等优势:本实验采用快速高效液相色谱法所测成分保留时间在1.3min,分析一个样品仅用2min——仅为普通液相三分之一,流动相消耗仅为普通液相十五分之一。同时,本实验还对样品测定的前处理条件如提取溶剂、溶剂倍量及超声时间进行了优选,所建立的测定方法简便、快速、可靠。3.2结果表明，甜茶素含量为采用建立的RSLC-DAD方法对中国和日本市面上共21份甜茶商品中甜茶素进行了测定,含量范围为0~63.79mg/g。3.2.1植物来源分析0066,0086和0111号样品中并未检测到甜茶素。考虑到这3份样品分别产自云南和湖南雪峰山,结合其显微特征,推测其植物来源应为壳斗科多穗柯IithocarpusploystachyusRehd而非广西甜茶,进而提示本方法可以将广西甜茶与多穗柯甜茶进行区分。3.2.2袋泡茶中甜茶素的含量从表2可以看出不同广西甜茶商品中甜茶素含量有明显差异:0118样品为甜茶糖果,甜茶素含量仅为5.45mg/g;0057和0065号样品为多种代用茶(广西甜茶、绞股蓝、桑叶、茯苓)混合而成的袋泡茶,含有较多的添加物,导致甜茶素含量偏低(分别为14.77mg/g和17.25mg/g);0125和0127为甜茶叶片,甜茶素含量较高,分别为63.79mg/g和45.11mg/g;其余14份样品均为袋泡茶,甜茶素含量范围为17.17~59.75mg/g。3.2.3广西平乐指标84.84.84.84.84.97.g本文收集的日本市售广西甜茶商品的原材料均来源于广西。因此根据含量测定的结果,得出不同产地的广西甜茶袋泡茶、茶叶甜茶素含量的差异:广西金秀(含量范围45.57~63.79mg/g,平均54.18mg/g)和广西平乐(59.75mg/g)含量最高,其次为广西桂林(53.33mg/g)、湖南永州(50.98mg/g)、广西玉林(45.11mg/g)、江西上饶(43.21mg/g)、贵州三都(29.99mg/g)、广西罗城(24.89mg/g)、广东惠州(17.17mg/g)。吴祖祥和唐辉分别采用分光光度法和红外光谱法对甜茶素含量进行了测定,均报道广西金秀产甜茶素含量较高。4不同部位、材料、干酵母粉含量对甜茶素含量的影响文献曾报道甜茶素在不同季节