乳及乳制品中三聚氰胺检测标准的对比

乳及乳制品中三聚氰胺检测标准的对比

三聚氰胺（化合物：c3h6n6），相对分子量：126,12。俗称密胺、蛋白精,IUPAC命名为“2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪”,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,常压条件下,354℃分解,其结构式为:。该品为白色单斜晶体,无味,微溶于水(3.1g/L常温),可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。其进入体内后似乎不能被代谢,而是从尿液中原样排出,但是由于各人体质不同,有人会在身体内产生与氰脲酸结合的晶体状聚合物,而引起肾结石、膀胱结石等病症。三聚氰胺不是食品添加剂,为何会出现在乳及乳制品中呢?食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量,由于蛋白质有一百多万个品种,直接测量蛋白质技术上比较复杂,所以国际组织公职分析化学家协会(AssociationofOfficialAnalyticalChemists,简称AOAC)制定了用凯氏定氮法的方法测定氮原子的含量,间接推算食品中蛋白质含量的方法,各种食品有不同的换算系数,其中乳制品的换算系数为6.38。世界各国都遵照执行该方法标准,我国也引用该方法标准作为国家标准。由于三聚氰胺含氮量(66%)与蛋白质平均含氮量(约16%)相比含有更高比例的氮原子,所以被一些造假者利用,添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象,从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。本文检索了相关的国家标准及文献,概述了乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法,主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱/质谱法。根据国家对于乳及乳制品中三聚氰胺不同的限量要求,可以采取适当的分析方法对乳、乳制品中的三聚氰胺进行定性、定量分析。1乳、领域的污染一些分析检测机构为了尽快得到分析结果,采用甲醇水、乙腈水作为提取试剂,离心分离,经过0.2μm的滤膜后直接进样分析。该种提取方法快速、简单,但是由于乳及乳制品的基体复杂,容易形成干扰,污染仪器。目前大多数检测机构均采用三氯乙酸-乙腈作为提取液,超声波震荡萃取,过滤,阳离子交换固相萃取柱净化,氮吹仪吹干,液相分析系统可以使用流动相定容后检测。由于三聚氰胺的极性很强,具有活泼的N-H,容易在气相色谱的进样口、毛细管柱中吸附,故气相系统分析三聚氰胺时多使用衍生化试剂(N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1))衍生后定性、定量分析。2定量、定性、定量分析目前文献报道的三聚氰胺检测方法主要有高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法。高效液相色谱法操作方便,线性范围宽,其检测原理为:使用三氯乙酸-乙腈作为提取液,将三聚氰胺从乳及乳制品中提取出来,经过阳离子交换固相萃取柱净化后,样品在离子对缓冲溶液的淋洗作用下在色谱柱上实现分离,紫外检测器检测,通过于相应标准物质出峰时间及峰面积的比较,实现定性、定量分析。该方法最终需要使用质谱进行确证,且检测限高,不能满足国家关于婴幼儿奶粉中三聚氰胺的限量要求。高效液相色谱-串级质谱联用仪的检测原理为:三氯乙酸-乙腈作为提取液,将三聚氰胺从乳及乳制品中提取出来,经过阳离子交换固相萃取柱净化后,样品在等体积乙酸铵和乙腈的淋洗作用下在色谱柱上实现分离,串级质谱检测,通过与标准物质色谱出峰时间及特征离子丰度比,实现定性、定量分析。该方法灵敏,但是仪器设备昂贵,具有该类检测设备的分析实验室很少。气相色谱-质谱联用仪(气相色谱串级质谱联用仪)的检测原理是:样品经过超声提取,固相萃取净化后,使用硅烷化试剂进行硅烷化衍生,衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式(SIM)或多反应监测质谱扫描模式(MRM),用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比进行定性分析,外标法定量。该方法增加了衍生化的过程,给分析结果带来了更多的不确定因素,但是该方法灵敏度高,目前国内多数分析实验室采用该方法分析婴幼儿奶粉中的三聚氰胺。下面叙述高效液相色谱法及气相色谱-质谱联用法(气相色谱串级质谱联用法)检测结构乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法。3高效液相色谱法3.1标准溶液的配制甲醇:色谱纯;乙腈:色谱纯;氨水:含量为25%～28%;三氯乙酸,柠檬酸,辛烷磺酸钠:色谱纯;三聚氰胺标准品(CAS108-78-01):纯度大于99.0%;微孔膜:0.2μm;海砂:化学纯,粒度0.65～0.85mm,二氧化硅含量为99%。甲醇水溶液:50mL甲醇和50mL水,混匀后备用。三氯乙酸溶液(1%):称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,备用。氨化甲醇溶液(5%):量取5mL氨水和95mL甲醇,混匀后备用。离子对试剂缓冲溶液:准确称取2.1g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠,加入约980mL水溶解,调节pH至3.0后,定容至1L备用。三聚氰胺标准储备溶液:准确称取100mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中,用甲醇水溶液溶解并定容至刻度,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液,于4℃避光保存。阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60mg,3mL,或相当者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。3.2超声波萃取装置高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器;分析天平:感量为0.0001g和0.01g;离心机:转速不低于4000r/min;超声波水浴;固相萃取装置;氮气吹干仪;涡旋混合器;具塞玻璃离心管;研钵。3.3实验步骤3.3.1样品提取3.3.1.提取样品前处理(1)称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞玻璃离心管;(2)加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈;(3)超声、震荡各提取10min;(4)10000r/min离心10min;(5)过滤样品;(6)准确移取5mL并准确加入5mL水,待净化。3.3.1.研钵、离心、提取(1)称取2g(精确至0.01g)试样于研钵;(2)加入8～12g海砂研磨成干粉状;(3)转移至50mL具塞玻璃离心管中;(4)用15mL三氯乙酸溶液清洗研钵数次,并将清洗液转移至离心管中;(5)加入5mL乙腈;(6)超声、震荡各提取10min;(7)10000r/min离心10min;(8)过滤样品;(9)准确移取5mL并准确加入5mL水,待净化。3.3.2淋洗液的制备(1)将待净化的溶液准确转移8mL至固相萃取柱中;(2)3mL水淋洗;(3)3mL甲醇淋洗;(4)抽至近干;(5)6mL氨化甲醇洗脱,收集淋洗液;(6)淋洗液于50℃下氮气吹干;(7)1mL流动相定容;(8)涡旋1min;(9)微孔过滤膜过滤,待仪器分析。3.3.3高效液铬测定3.3.3.流动相13.2(1)色谱柱:C8柱,250mm×4.6mm(i.d),5μm,或者相当者C18柱,250mm×4.6mm(i.d),5μm,或者相当者;(2)流动相:C8柱,离子对试剂缓冲液-乙腈(85+15,体积比),混匀或C18柱,离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10,体积比),混匀;(3)流速:1.0mL/min;(4)柱温箱:40℃;(5)波长:240nm;(6)进样量:20μL。3.3.3.标准曲线方程的建立流动相稀释三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度0.8、2、20、40、80μg/mL的标准工作液,按上述色谱条件分析,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线方程。3.3.3.3-定性和定量分析按上述色谱条件将处理好的样品注入液相色谱仪进行分析,根据工作曲线进行定性定量分析。3.3.4三聚氰胺含量的测定实际样品中三聚氰胺的含量根据下式进行计算:X=A×c×V×1000As×m×1000×fX=A×c×V×1000As×m×1000×f式中:X—试样中三聚氰胺的含量(mg/kg);A—样品溶液中三聚氰胺的峰面积;c—标准溶液中三聚氰胺的浓度(μg/mL);V—样品最终定容的体积(mL);As—标准溶液中三聚氰胺的峰面积;m—试样的质量(g);f—稀释倍数。3.4方法的固定限制该方法的定量限为2mg/kg。3.5返回率在添加浓度为2～10mg/kg浓度范围内,回收率在80%～110%之间,相对标准偏差小于10%。4质量分析的联合应用和质量分析的质量分析方法4.1tfa,三甲基氯硅烷,tmcs吡啶(色谱纯);衍生化试剂:N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1),(色谱纯);乙酸铅溶液(22g/L):取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L;氩气:纯度>99.999%;其余同高效液相色谱法。4.2设备气相色谱-质谱联用仪(气相色谱-质谱/质谱仪):配有电子轰击电离离子源(EI)。其余同高效液相色谱法。4.3实验步骤4.3.1气相色谱-质量分析的联合应用4.3.1.氯乙酸溶液提取(1)称取5g(精确至0.01g)试样于50mL具塞玻璃离心管;(2)加入25mL三氯乙酸溶液;(3)涡旋30s;(4)加入三氯乙酸15mL;(5)超声提取15min;(6)加入2mL乙酸铅;(7)三氯乙酸定容至50mL;(8)10000r/min离心10min,上清液待净化。4.3.1.氯乙酸溶液(1)称取5g(精确至0.01g)试样于50mL具塞玻璃离心管;(2)5mL热水溶解;(3)加入20mL三氯乙酸溶液;(5)涡旋30s;(6)加入三氯乙酸15mL;(7)超声提取15min;(8)加入2mL乙酸铅;(9)三氯乙酸定容至50mL;(10)10000r/min离心10min,上清液待净化。4.3.1.淋洗液收集(1)将待净化的溶液准确转移5mL至固相萃取柱中;(2)3mL水淋洗;(3)3mL甲醇淋洗;(4)抽至近干;(5)3mL氨化甲醇洗脱,收集淋洗液;(6)淋洗液于50℃下氮气吹干待衍生化。4.3.2气相色谱-质量分析4.3.2.超声提取液ml甲醇(1)称取0.5g(精确至0.01g)试样;(2)加入5mL甲醇水溶液;(3)涡旋2min;(4)超声提取15～20min;(5)10000r/min离心10min;(6)取上清液200μL用微孔过滤膜过滤;(7)50℃氮气吹干。4.3.2.超声提取液l液(1)称取1g(精确至0.01g)试样;(2)加入5mL甲醇水溶液;(3)涡旋2min;(4)超声提取15～20min;(5)10000r/min离心10min;(6)取上清液200μL用微孔过滤膜过滤;(7)50℃氮气吹干。4.3.3衍生化-质谱法在上述氮气吹干的残留物中加入600μL吡啶和200μL衍生化试剂,混匀,70℃反应30min,氮气吹干,准确加入800μL吡啶,供气相色谱-质谱及气相色谱-质谱/质谱定性定量分析。4.3.4仪器的参数4.3.4.温度条件(1)色谱柱:5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱,30m×0.25μm×0.25mm(i.d.)或者相当;(2)载气流速:1.0mL/min;(3)传输线温度:250℃;(4)进样口温度:250℃;(5)进样量:1μL;(6)进样方式:无分流;(7)程序升温:70℃保持1min,以10℃/min的速率升温至200℃,保持10min;(8)离子源温度230℃;(9)扫描模式:选择离子扫描:定性离子m/z99、171、327、342,定量离子m/z327。4.3.4.多反应离子监测(1)碰撞气:氩气,200.0～266.6mPa。(2)扫描方式:多反应离子监测,定量离子m/z342>327(碰撞能量15kV),定性离子m/z342>171(碰撞能量20kV)。其余条件同气相色谱-质谱法。4.3.5就业曲线的绘制4.3.5.标准工作曲线的绘制将三聚氰胺标准溶液逐级稀释,配制成衍生物浓度为:0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μg/mL的标准溶液,气相色谱-质谱仪分析,以浓度与定量离子的峰面积作图,绘制标准工作曲线。4.3.5.标准工作曲线的绘制将三聚氰胺标准溶液逐级稀释,配制成衍生物浓度为:0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1μg/mL的标准溶液,气相色谱-质谱/质谱仪分析,以浓度与定量离子的峰面积作图,绘制标准工作曲线。4.4测量的测量待测溶液中三聚氰胺的响应值应在工作曲线的线性范围内,超过线性范围则应对净化液稀释,重新衍生化后再分析。4.5定性试验4.5.1煤气相图的质量谱法以标准样品的保留时间和监测离子(m/z99、171、327、342)定性,待测样品中4个离子的丰度比相差不大于20%。4.5.2气相色谱-质量分析以标准样品的保留时间及多反应监测离子(m/z