cd4+cd25+foxp3+reg细胞在哮喘变应原雾化吸入减敏治疗中的作用

cd4+cd25+foxp3+reg细胞在哮喘变应原雾化吸入减敏治疗中的作用

气管哮喘是一种由各种细胞和细胞组成的慢性呼吸道炎症疾病。根据全球哮喘防治创议(GINA),哮喘治疗方案是以长期吸入糖皮质激素为主的抗炎治疗。但糖皮质激素未能针对病因进行治疗,持续应用会带来一些不良反应。变应原免疫疗法(AIT)对涉及Ⅰ型过敏反应的疾病有效。特异性变应原免疫治疗被认为是唯一针对病因、改变哮喘自然病程的哮喘治疗方法,常规以皮下注射方式减敏治疗。在哮喘大鼠模型中用雾化吸入特异性变应原减敏,揭示该法具有临床应用的良好基础和可行性。调节性T细胞(Treg)具有免疫调节和免疫抑制作用,是哮喘发病机制中的重要细胞,CD4+CD25+调节性T细胞在控制哮喘和过敏性疾病中起重要作用。我们主要探讨特异性变应原雾化吸入减敏疗法对过敏性支气管哮喘的防治作用及与CD4+CD25+Foxp3+Treg的关系。1数据和方法1.1仪器、试剂和仪器PE-anti-humanCD25、PE-Cy5-anti-humanFoxp3、FITC-Anti-humanCD4及同型对照抗体(美国eBioscience公司),Intraprep透膜剂、流式细胞仪(美国Backmancoulter公司),佛波脂(PMA)、布雷菲德菌素A(BFA)、离子霉素Ionnmycin、莫能霉素Monensin(以上均为美国Sigma公司),阿罗格点刺液及阿罗格变应原(德国默克·阿罗格制药有限公司),肺功能检测仪(MasterScope,德国耶格公司)。1.2实验方法1.2.1皮肤过敏原测试根据中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的哮喘诊断标准,2011年1月-2011年12月在我院门诊确诊为慢性持续期、中度支气管哮喘;粉尘螨、屋尘螨皮肤过敏原测试为阳性(强度≥+++);初诊或3个月内未按GINA方案规范治疗,排除有吸烟史,高血压病、心脏病、肝或肾及其它肺疾患,1个月内有明显呼吸道感染史者。收集患者40例,其中男性16例,女性24例,年龄19～50岁,平均年龄(32±9.6)岁。随机分为常规治疗组(A组)、吸入减敏组(B组),各20例。1.2.2雾化独立独立释放所用患者填写知情同意书,给予相同的基础治疗,即吸入替卡松/沙美特罗50/250μg,2次/d;可按需使用万托林。B组按每周2次雾化吸入特异性变应原,持续6个月。以起始浓度(-3级)的最小剂量0.05ml加入5ml生理盐水中,以后患者依次使用0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml的剂量加入5ml生理盐水进行雾化吸入;每个浓度吸入6次,而后提高一个浓度级继续上述方案。每次雾化吸入结束后留观30min,观察有无过敏反应,如出现立即停止本次治疗,并在下次脱敏时降低变应原浓度。备地塞米松、肾上腺素等急救药品和物品。A组雾化吸入以生理盐水5ml代替,亦每周2次,持续6个月。治疗前后取患者外周血。1.2.3哮喘常规量治疗前和治疗后分别参照文献,采用哮喘控制测试(asthmacontroltest,ACT)来观察哮喘患者的症状控制情况。1.2.4肺功能与呼吸道反应的测定在患者治疗前、后进行,检查前停用舒立迭24h,停用万托林12h。1.2.5含离子霉素的大鼠血清的培养液含胎牛血清取外周血2ml,枸椽酸钠抗凝,置于室温。500μl抗凝血加入含25μlPMA,20μl离子霉素、20μlBFA、117μl莫能霉素,RPMI1640(含胎牛血清)培养液至1ml,混匀。置于37℃、50ml/LCO2培养4h。1.2.6pe-cy5-检测细胞的生长将经活化的外周血标本加入1.5μlFITC-Anti-humanCD4,细胞均分为两管(A、B),往A管中加入1μlPE-anti-humanCD25,B管加入相应同型对照抗体,孵育30min(4℃,避光)。洗涤2次,A管内加入Intraprep#1100μl、室温暗处孵育15min,加入PBS液4mL,1500r/min,离心5min,弃上清,加入Intraprep#2100μl,室温避光孵育5min。洗涤2次,将A管细胞均分为2管,分别加入2.5μlPE-Cy5-anti-humanFoxp3及等量PE-Cy5标记同型对照抗体,4℃、避光孵育30min。加入PBS液4mL洗涤,1500r/min离心5min,弃上清,溶血机溶血。洗涤2次后重悬细胞上机行流式检测,FCSExpress软件分析数据。1.3统计方法采用SPSS17.0软件,计量资料以(x¯±s)(x¯±s)表示,采用t检验。两样本率的比较采用χ2检验。2结果2.1两组治疗前后t治疗前A、B两组哮喘控制评分比较,差异无统计学意义。治疗后两组哮喘控制评分均高于治疗前,差异有统计学意义(t=5.132,P<0.01;t=13.46,P<0.01);两组治疗后比较,B组评分明显高于A组(t=2.701,P<0.05)。见表1。2.2两组肺功能比较治疗后B组气道反应性较前降低,A组无明显变化见表2。。治疗后两组肺功能均有明显增加,差异有统计学意义(t=13.14,P<0.01;t=22.37,P<0.01),但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。2.3+t细胞占cd4+t细胞比例治疗后B组外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T淋巴细胞百分比明显高于治疗前(t=12.62,P<0.01),高于A组(t=12.12,P<0.01)。见表1。3cd4+cd25+treg细胞在外周血和体内表达的变化变应原特异免疫疗法(AIT)又称脱敏疗法(desensitization),被认为是目前临床上可以改变过敏性疾病自然进程的唯一治疗方法。AIT可以减轻炎症,降低非特异性气道高反应性,并且预防新的过敏反应发生,对过敏性鼻炎患者的AIT治疗,可以预防患者发生过敏性哮喘。AIT治疗可降低Th2型细胞因子,升高抗炎因子如IL-10和TGF-β的水平,并提高Treg细胞的数量或活性,从而降低了过敏性免疫反应。还可能降低特异性IgE抗体的产生,而提高特异抗原的IgG型阻滞抗体的产生。CD4+CD25+Treg属于天然调节T细胞(nTreg),是Treg的主要组成部分,Foxp3特异性地高表达于CD4+CD25+Treg,参与其发育、分化,与其抑制功能相关。CD4+CD25+Treg数量减少和Foxp3表达减少在哮喘的Th1/Th2失衡中扮演重要角色。FrancisJN等的研究表明特异性免疫治疗诱导产生IL-10的Treg增加,从而抑制过敏性疾病的炎症反应。分泌产生IL-10的调节性T细胞是属于诱导性调节T细胞(iTreg)的一类Treg亚群,一般称为Tr1细胞。本研究结果显示,哮喘患者经特异性变应原雾化吸入减敏后哮喘控制测试评分升高,