蝴蝶兰的快速无性繁殖

蝴蝶兰的快速无性繁殖孙佳林(东北业大学园艺学院，哈尔滨150030)摘要：以蝴蝶兰(Phalaenopsis)的花梗侧芽及花序顶端为外植体，在Kyoto或MS+BA3ppm培养基中诱导出营养芽。以试管植株的茎尖、茎段、叶片在MS4-BA0.5-5ppm或Ms+BAO.5-5ppra4-NAAlppm的培养基中，诱导出不定芽或原球茎状体(Protoeorm〜Like-Body,PLB.)在附加BA54-NAAl的培养基里，茎段不定芽诱导率为65,叶片PLB诱导率为16.7%，用MS+BA1ppm进行LIj继代培养可获得大量群体，进一步培养可形成完整小苗。由蝴蝶兰花梗侧芽而来的白花无性系品种(Pha1.(phylliskeyxbandleader)xcetebration?巳大量出瓶秽栽。在广州地区，蝴蝶兰出瓶苗种植23年即可开花。蝴蝶兰形态美妙，色彩鲜丽，花期持久，在热带兰中，素有“兰花皇后”的美称，在花卉市场上，是一种商氆商品兰花。蝴蝶兰量堕萎性气生兰，疆株上极少发育例枝，比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖。组织培养是建立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。在蝴蝶兰的无性繁殖方面，据报道1949年Rotor成功地在试管中培养出花梗苗。但大量的应用研究是在六十年代以后，尤其是七十年代至八十年代(4-187。所选用外植体材料有花梗倒芽、茎、叶片、根尖等。方法各异，难度各有高低。我国除台湾省的林金其、林瑞松等也对蝴蝶兰的组织培养作了认真的研究外(1、z、11),其他地方尚未见有报道。本研究在研究期问，曾进行了花梗例芽诱导营养芽｝不定芽增殖j茎尖、茎段、叶片原球茎状体(PLB)诱导｝PLB增殖J完整植株培养等试验。材料与方法1.1材料t蝴蝶兰杂交科-：Phal。(phytli,~keyxbandleader)Xcelebration(白花)，Phal。hyd(黄花)，PTI『.hyhrid(红花)1.2外植体及消毒剪取正在开花或开花后的花梗，剥除已开放的花朵及花莆，用漂粉精溶液(15片/tOOm1)消毒20—30分钟，剥去苞叶，露出侧芽，再消毒5分钟，无擅水冲洗5—6次。1.3兰接种和培养将消毒后的花梗，切成2〜3cm长的切段，每段带一侧芽'花序顶端则切成约。6era长短，基部向下插于培养基上。培养室温度为25±l°C,光照度'5001x,光照10h/d。营养芽诱导培养基：A.Kyoto培养基。Hypoaex(7一6一19)花宝1号3g，琼脂I2g，胰蛋白胨2g，水10们I，蔗糖36g，PH=s.o—5。13.MS+B'Agpprn。1.4试验程序：外植体一营养芽诱导a—不定芽一增殖一长根一完整植株一出瓶b—茎头一PLA诱导一增殖一完整小苗一出瓶c—茎段一PLA诱导一增殖一完整小苗一出瓶d—嫩叶片一PLA诱导一增殖一完整小苗一出瓶2结果2.1花梗侧芽和顶弗的诱导本试验的目灼是使休眠的花梗侧芽和顶芽启动，形成营养芽，在试管内长成无菌植栋，便于进一步利用。应黾A、B两种培养基作为营养芽诱导培养基，接种七天左右，侧芽膨大并向外伸长，30天后长出小叶50天左右可长出4〜5片l咔。这时，花梗组织及植株基部均变黑色，所分泌的代谢物质将培养基染成黑色。培养基上的植株虽然生长良好，但应尽快转移到新鲜培养基上。在A培养基上，例芽多长成单椿小苗。在B培养基上，删芽可萌发废丛生芽（图版一1）。花序顶端小芽的启动则比较慢，40—5。天后，才见小叶伸出。2.2不定芽的诱导及增殖将试管内植株切离花梗，将茎段横切为上、下两段，转入附加BA或BA+NAA的MS培养基中，约30天左右，小芽及茎段的基部膨大并长出不定芽，son左右幼芽长大，可将幼芽切离，继续接种于培养基中增殖丛芽（图版一2），周而复始，可得较大数量的丛生芽在MS+BA3ppm培养基中，不定芽诱导率为50。在MS+BAs+NAAt培养基中，诱导率达65%（表1）统计不定芽的年增殖率，铸果表明，以50天为一周期，每芽增殖芽数=342（x）±0。69（s）即每芽年增殖数上限为19810撑，下限为1130（置信度a=95%）2.3原球蓥状体的诱导茎尖诱导原球茎状体，在双目解剖镜下剥取试管植株的茎。取下的茎尖直径约0.m，接种｛：Ms+DA3ppm培养基上，在光照条件下培养，l4天后观察，肉限可见茎尖膨大，呈浅绿色半球状，直径约1.5mm。三个碍后，长成的桑果状原球茎状体组织块直径约6mm（图版一3）。用叶片和茎段诱导原球茎状体，将试管植株的嫩叶片整块或横切成上、中，下三段｝同样，将试管植株的茎段整株或横切成上、中、下三段，分别接种在培养基上。基本培养基为Ms,附加不同浓度的BA稠NAA。接种后20天，可见叶片弯曲，近离培养基的切口出现愈仿组织微粒，而接触培养基的切口则分泌出黑色代谢物质，但I~-,q'仍保持绿色，几乎维持5—6个月才逐渐褐化（此现象与林金其c：）在花梗节闯切片培养中所观察的情况相似）。只有极个别的嫩叶片基部或断裂1=I呈现凹凸不平，逐渐出现愈伤组织状的早期原球茎状体（图版一4）。茎切段的培养情况与上述情况相似，但愈伤组织多在接近培养基处或深埋培养基处出现。接种90天后调查，143个叶片外植体中只有9个外植体出现愿球茎状体，总诱导率为6.3。l6o个茎段外植休中，有14个出现原球茎状体，总诱导率为8.8，但有37个茎段出现不定芽，不定芽的总诱导率为23。附加不同激素对茎段和叶片原球茎状体和不定芽诱导率曲影响（表1）。表1附加不同激聖对醐幌兰茎段和叶片原球茎状体和不定旁诱异率（嗾I的彬响附加激累（mg/L）茎切段PLB茎切段丛生芽叶片PLB形成数/外植悴數诱导率形成數/外植休數诱拆率形咸数/外植休数诱导率BAO30/2100/2100/180BA10/1502/1513.31/IS5.5BA33/22611/2250.02/16J2.5BA53/1816.73/1816,71/2050BA0.5+NAA14/2020.01/205.00/190BAI+NAA11/147.1Q/1401/263.8BA3+NMI2/306.77/3023.31/812.5+NAA1-L/205.013/2065.U3/L816.72.4原球茎状体的增殖早期原球茎状体外观像愈伤组织，表面球状物不明显。继续培养，可见表面突起一：个千圆球，部分表面细胞分化出根毛状物。如果不切割原球茎状体，让它们在不含或只含低浓度细胞激动素的培养基里继续生长，60天后陆续长出芽，成为完整的原球茎。100天后，大部分已长成有2—3片叶的小苗。为达到大量繁殖韵目的，必须加快原球茎增殖速度。在原球茎状体阶段进行增殖是最理想的，原球茎状体形成君，在无苗条件下取出切成小块，转移到MS+BA1ppm培养基中继代培养。在切块细小，稀疏的培养瓶内，群体生长较慢，而在切块较大且密集的培养瓶里，群体生长十分旺盛，表现出一定的群体生长效应（图版5）2.5不同培养基对小苗长根的影响表2不同培养基对糊蝶兰苗长根的影响培养基4周10周调查楞数长根棵数生根率（馮）關査株数任根栋数主根率他）Kyoio231082.6123229565MS+IAAO.L26g30.772B1760.71MS+1BA0.128932,14251352.002.6试管苗的出瓶移栽及开花情况在广州地，蝴蝶兰的试管苗出瓶移栽可在3-10月进行，以4—6月出瓶效果虽好。出瓶时，甩清水将附在小苗根上的培养基洗净，然后移植在干净的水苔或椰糠上，放置阴凉湿润通风处，一个月后，开始喷施液肥待小苗新叶长出时，移植到小盆或蕨板上：出瓶后的楦株一般两年即可Jf花该无性系花色洁白，花型丰满，花期持久，每杖花花期均长达60天以上。花径约8Cm。第二年和第三年开花枝每枝有5—7朵花，随着植株的年龄增长，每枝花的朵数增多。该无性系后代保持了原母株的优良特性。（图版〜7、8）3.讨论3.1蝴蝶兰是单茎性气生兰，适于以花梗作为外植沐建立快速繁殖无性系。其优点是不损母株，开花后取材，对母抹曲整体情况得以了鲟。特别是从外地弓I入的新品种，可以待植株开花后，确定其观赏价值后再进行大量繁殖。3.2蝴蝶兰花轴基部的芽往往l为休眠芽，花序顶端则含有未完全分化的花原始侔，本试验使休眠芽启动，使顶端向营养芽转化，均未通过脱分化过程形成愈伤组织，之后如采用丛生芽方式增殖，尽管增殖系数较低，但对减少变异，保持母株特性是有利的。3.3花轴基部的休眠芽有两种发育可能，一是长成幼小植株，二是长成花枝。花梗删芽的分化方向受翎芽的发育程度、温度、激素等诸因素影响。低温有可能导致体眠芽向花芽分化作者在1988年2、3月接种的-}it花梗侧芽，受较低温度影响（15—22oC）,结泉太部分发育成花芽这些花芽继续培养35天，待花梗长度约2.5—3.5cin时，将其切成段，在较高的温度下（23-26~C）继续培养，结果，新花梗上的节问侧芽又长成了营养芽田中道男等的研究表明［9），当培养温度为28°C时，花梗侧芽向营养芽分化，在20~C的低温下，则多数伸长成为花芽。附加细胞激动素6BA，有利于花梗侧芽萌发，向丛生芽方向发展。以花梗侧芽为外植体建立无性系目的在于取得营养植株，建议培养条件采用温度25—28C，光照15001X,并在培养基中附加1—3ppm的BA。3.4目前开花的植株均为确基芽苗，因而变异不大。山叶片和茎段脱分化产生愈伤组织形成