蛋白质工程试题

蛋白质分子的构型与构象构型：是分子中原子的特定空间排布。当构型相互转变时，必须有共价键的断裂和重新形成。基本构型有L-型和D型两种。这种构型无法通过单键的旋转相互转换。构象：是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，构象的转换不要求有共价键的断裂和重新形成，在化学上难以区分和分离。上核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构。van'tHoff焓平衡常数与焓熵的关系式为_RTlnK=△H-TAS。取对数可以变为：InK=—△H/RT+AS/Ro进一步推导可以变为：d(InK)/d(1/T)=—AH/R。基于此，以InK对1/T可以得到一条曲线。在这条曲线上任何一点的斜率就是AH/R,其中的AH称为van'tHoff焓。通过解析van'tHoff焓随温度变化的曲线特点，可以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。也就是通过这样的曲线分析，可以预测蛋白质天然构象退在折叠时的容易程度。盒式突变法也称为片断取代法(DNAfragmentreplacement)。这一方法的要点是禾U用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体meltonglobule。熔球体具有天然态的大多数二级结构，但不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，环肽区和表面结构多数处于未折叠状态，侧链可以活动。非折叠态卷折成熔球体包含了蛋白质折叠的主要奥秘一疏水侧链的包埋。反向折叠设计在蛋白质工程中，全新蛋白质设计是以弥补天然蛋白质结构和功能在应用方面的不足为目的，根据人类所希望的结构和功能，采取工程手段，来人工设计新的氨基酸序列，这样的设计研究称为反向折叠研究。在全新蛋白质设计的反向折叠研究中，需要采取的基本策略是通过设计新的氨基酸序列,来加强或者减弱蛋白质的某些相互作用力，使设计的序列能最终具有所希望的结构和功能。功能基团的特异性修饰蛋白质中，不仅末端氨基酸具有氨基和羧基，很多链中氨基酸侧链也具有羟基、巯基、氨基和羧基等能进行特征性化学反应的功能基团。利用这些功能基团的化学反应性可以进行蛋白质功能基团的特异性修饰。基因突变技术在基因水平上设计并使某特定基因发生变异，对该基因所编码的蛋白质进行改造，在突变基因表达后、用来研究蛋白质结构功能的一种方法。融合蛋白质重组DNA技术允许在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产生的蛋白质叫做融合蛋白质。蛋白质工程就是以蛋白质的精细结构和生物功能间的相互关系为基础，主要以基因工程为手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然蛋自质甚至于创造自然界本不存在的、具有优良特性的新的蛋白质分子。在蛋白质分子中，特别在球蛋白分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合(Combination),称为超二级结构或者称为结构模体、或者标准折叠单位全新蛋白质的设计过程，与正向折叠研究过程相反。它是以弥补天然蛋白质的结构和功能在应用方面的不足为目的，根据人类所希望的结构和功能，采取工程手段，来人工设计新的氨基酸序列，这样的设计研究称为反向折叠研究基因重组表达技术的应用是实施蛋白质工程的主要途径。然而，利用基因重组表达技术产生的突变基因在生物体内有时无法有效表达，从而影响目标蛋白质产品的有效获得。利用化学方法直接改变蛋白质分子，可以弥补分子生物学途径中蛋白质表达体系的不足，而且往往可以获得具有新奇功能的蛋白质或肽链产品。蛋白质工程研究的基本途径是：从预期功能出发，设计期望结构,寻求与之相对应的氨基酸序列；再转译成核苷酸序列，形成人工基因；最后采用基因工程技术通过生物合成产生新蛋白质。通过蛋白质的热力学研究方法可以为鉴别蛋白质分子的天然态和退折叠态提供信息。可以重新折叠的退折叠态被认为是多肽链在热力学平衡条件下构象不停地变化的状态。平衡可以向天然态移动，也可以向退折叠方向移动，移动的方向取决于环境条件的变化。虽然，热力学方法能提供蛋白质多肽链构象状态的信息，但是，无法分析状态变化过程的时间效应。为此，需要开展折叠过程的动理学研究。在生体细胞内蛋白质一级结构中的疏水基团趋向于埋藏在蛋白质分子内部，亲水基团则倾向于暴露在分子表面。在蛋白质设计开始之前，要对所要改造的天然蛋白质进行表征，内容包括：结构检索(依据ProteinDataBank)分析、功能鉴定和活性筛选以确定其氨基酸序列、三维结构、稳定性、催化活性等设计一个新奇蛋白质结构的中心问题是设计一个具有稳定的、独特的三维结构序列。而稳定的、独特的三维结构的形成意味着氨基酸序列由线性聚合链I勺相对无序状态转换为高度的有序状态。在这样一个与自发的能量转换相反的过程中，需要克服的基蛋白质的修饰和表达处于蛋白质工程的实施阶段核心位置。修饰包括直接对蛋白质分子的化学修饰和基于基因突变技术的分子生物学修饰；而表达则是关系蛋白质产品获得成效的关键环节。蛋白质工程中实施的基因突变主要有4种类型：基因的专一性位点突变、基因的区域性定向突变、基因融合和基因剪接、tRNA介导定点参入非天然氨基酸蛋白质的热力学与动理学的研究表明：具有生物活性的蛋白质天然态是在热力学平衡状态下的单一构象状态，而失活态则是多构象状态。—般而言，在生体细胞内蛋白质一级结构中的疏水基团趋向于埋藏在蛋白质分子内部，亲水基团暴露在分子表面。在形成这样的疏水核心的同时，必然有一部分亲水性主链被埋在里边。为了解决这样的能量不稳定的矛盾，处于分子内部的主链极性基团需要被一种作用力一氢键中和，才能达到能量的平衡。在这种能量平衡中，蛋白质主链会产生折叠而产生由氢键维系的有规则的构象，称为二级结构。蛋白质工程与基因工程、酶工程的关系蛋白质工程与基因工程、酶工程关系密切，但也有着本质的不同。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。酶工程是将生物界已存在的酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产生活等各方面的一门科学技术(如：利用a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，生产出高果糖浆；利用加酶洗衣粉降解衣物有机质等)。而蛋白质工程则是进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。在蛋白质溶液体系中，影响蛋白质构象形成的作用力蛋白质分子的多肽链是具有氨基酸侧链的线性分子。蛋白质多肽链的构象除了取决于共价键(在合成中形成的共价键、合成后部分蛋白质二硫键的形成或断裂以及合成后的加工)夕卜，在细胞溶液中，合成后还要经过氨基酸残基间和不同肽段间的非共价键相互作用，形成一定的构象角组合，在此基础上形成特定的构象，也就是具备了特定的三维结构。基因的区域性定向突变基因工程技术不仅可以产生位点特异性突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法有盒式突变法(Cassettemutagenesis)，也称为片断取代法(DNAfragmentreplacement)。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。这样，不仅可以通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构和功能之间的关系，也可以通过盒式突变产生嵌合蛋白质。蛋白质分子设计的必要性、目的和途径必要性：由于有着巨大分子量的蛋白质分子含有大量的氨基酸，以随即方式改变天然蛋白质的氨基酸序列、创造具有新型氨基酸序列的蛋白质工程，无法有效地获得具有新型三维结构和功能的蛋白质分子。为了解决这一难题，实施蛋白质工程时，需要以蛋白质的结构和功能研究为基础，首先有目的地有效开展蛋白质的分子设计。(2)目的：1.为蛋白质工程提供指导性信息；2•探索蛋白质的折叠机理。(3)途径：1.基于天然蛋白质结构的分子设计；2•全新蛋白质设计。在蛋白质的修饰改造中Kunkel突变法的原理这种方法是由Kunkel在1985年发明的。先将突变的基因克隆在M13噬菌体载体上，然后转染大肠杆菌。作为受体的大肠杆菌是一种dut-ung-突变的菌株。dut-突变导致大肠杆菌中dUTPase有缺陷，因此细胞中的dUTP无法转变为dUMP而大量积累，最终导致—部分尿嘧啶参入到正常复制的DNA上，使尿嘧啶代替正常情况下的T。ung-突变导致大肠杆菌中尿嘧啶-N-糖基化酶有缺陷，因而不能除去DNA结合的尿嘧啶。在大肠杆菌dut-ung-F1菌株中，生长中的M13噬菌体最终产生的含外源基因的DNA(+)链上含有20—30个尿嘧啶。以这种DNA(+)链做模板，与含有突变的寡核苷酸引物混合，同源序列将退火。在DNA聚合酶、4dNTP存在的情况下，引物延伸，合成一条互补链。该链含有突变区段，但不再含尿嘧啶，接着在DNA连接酶的作用下，封闭缺口而连接。当这种M13双链分子转染野生型大肠杆菌后,DNA上的尿嘧啶很快被除去，导致模板链在复制前就被除去，而含有突变基因的无尿嘧啶链则能正常复制。最终获得的噬菌体，大部分由这种无尿嘧啶的突变基因链形成，从而很好地抑制了野生型M13噬菌体的形成。约50%以上的噬菌体斑含有突变基因，大大提高了突变体产生的效率。蛋白质的热力学性质分析中热容量实验的内容近30年来发展起来的微分扫描量热仪实验，使得在蛋白质的折叠或者退折叠过程中，通过直接测定热容量的变化，可以测定得到焓变化和熵变化。测定热容量时，微分扫描量热仪以恒定的速率加热放在量热池中的蛋白质溶液和作为参照的缓冲液量热池。使两个量热池维持相同的温度时，两个量热池在热量需求上的差别，就是两池中液体热容量的差别。由于缓冲液量热池的热容量是已知的，所以可以据此求得蛋白质量热池的热容量。热容量反应了热过程中的能量信息，也就是焓和熵作为热力学量与体系对热量的吸收有关。在压力恒定的条件下，dH二cdT。热量的增加一方面使体系的内能增加，另一方面通过使体系的体积改变也会对环境做功，所以与吸热直接相关的是焓而不是内能。体系热容量的大小与体系的微观组分排布方式所吸收的热量有关，所以热容量也与熵有关。这样，在定压的条件下，热容量和熵的关系可以描述为：dS二dH/T二cdT/T。由此可见，通过热容量实验，测定得到焓变化和熵变化，可以预测蛋白质体系构象的稳定性。蛋白质设计中需要遵循的基本原理（1）内核假设：所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构；（2）蛋白质内部结构的密堆积和无重叠特征；（3）蛋白质内部氢键的形成要最大限度地弥补溶剂键断裂所带来的能量损失；（4）疏水和亲水基团要合理地分布在溶剂不可及表面和可及表面；（5）在金属蛋白质中，配位残基的替换要满足金属几何配位原则；同时，围绕金属中心要有第二壳层的存在；（6）最优的氨基酸侧链几何排布；（7）结构和功能的专一性。四、论述题2.利用基因工程技术定向改造蛋白质的主要类型与内容（1） 基因的专一性位点突变：专一性位点突变都是在含有突变序列的寡核苷酸引物的介导下进行的，因此称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。在这类突变中PCR技术的应用非常普遍。主要有：Kunkel突变法、PCR的突变法、基于抗生素抗性恢复的突变法、基于去除特定限制酶切位点的突变法等。（2） 基因的区域性定向突变：基因工程技术不仅可以产生位点特异性突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法有盒式突变法（CasseTTe,mutagenesis），也称为片断取代法（DNAfragmenTreplacemenT）。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。这样，不仅可以通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构和功能之间的关系，也可通过盒式突变产生嵌合蛋白质。（3） 基因融合和基因剪接：利用重组DNA技术和PCR技术也可以在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产生融合蛋白质。（4） TRNA介导定点参入非天然氨基酸：通过引入非天然氨基酸到蛋白质分子中，不但可以对蛋白质的结构有更深的了解，也可以为生物医学的研究提供新的手段。

1.蛋白质工程的学科基础、基本原理、过程与主要内容（可以作图辅助说明） 蛋白质工程就是以蛋白质的精细结构和生物功能间的相互关系为基础，以基因工程为手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然蛋白质，甚至于创造自然界本不存在的、具有优良特性的新的蛋白质分子；是由分子遗传学、结构生物学、基因重组技术、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科的融合而成的新兴生物技术领域。四、论述蛋白质修饰的化学途径中对功能基团进行特异性修饰的主要类别与内容蛋白质中不仅末端氨基酸具有氨基和羧基，很多链中氨基酸侧链也具有羟基、巯基、氨基和羧基等能进行特征性化学反应的功能基团。利用这些功能基团的化学反应性可以进行蛋白质功能基团的特异性修饰。1多位点取代（1）氨基保护：氨基可以被Boc（酸不稳定取代基）、Msc（碱不稳定取代基）等基团取代。这些取代基团常用于对氨基的保护，以防止其他反应对氨基的作用。其他反应完成后，可以分别用无水三氟乙酸和强碱将取代基团去除。去除后，很多蛋白质仍可保留活性。（2）亚氨代乙酰化：大多数氨基取代反应无法将a氨基和£氨基区分，然而亚氨代乙酰化反应是例外。当£氨基完全被亚氨代乙酰基取代时，a氨基几乎不被取代。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍然保持原蛋白的可溶性等性质。去除这个取代基时，可用强碱处理。（3）羧基的甲基酯化：室温下，将蛋白质加入到含有乙酰氯的无水甲醇中时，羧基可以被甲基化。甲基化的蛋白质溶液经过冰水稀释，并且用碱中和，可以使保持其活性。（4）巯基的氧化：半胱氨酸侧链含有容易被氧化的巯基。巯基氧化后形成的二硫键可以使用二硫苏醇糖被还原。而经过磺酸氧化后得到的磺酸化半胱氨酸对进一步的氧化作用很稳定，而且可以通过将其还原