大剂量过敏反应致敏小鼠及正常小鼠dc共刺激分子表达及cd4

大剂量过敏反应致敏小鼠及正常小鼠dc共刺激分子表达及cd4

哮喘患者在接触外部变应原后会出现过度的th2免疫反应，导致变应性呼吸道炎症反应。然而，正常接触后的变应原并没有具有相同的免疫反应，这表明哮喘患者在拒绝外部“伤害”后没有失去进食能力。过敏原特异性免疫治疗(SIT)可以在一定程度上改善这种缺陷,是目前已知惟一针对哮喘病因的治疗方法,但其详细的机制目前尚不完全清楚。我们既往研究也发现,大剂量过敏原在体外可诱导哮喘小鼠T细胞不反应性,与DC分泌IL-10和TGF-β水平无关,其具体机制目前尚不清楚。研究发现DC表面共刺激信号如CD80、CD86、OX40L、ICOSL以及PD-L1/PD-L2等共刺激分子对免疫耐受均有不同调控作用。因此,我们推测大剂量过敏原可能通过影响DC表面共刺激分子表达来诱导耐受。近年来还发现调节性T细胞(Tregs)在调控免疫应答方面有着很重要的作用,过敏原免疫治疗成功往往与诱导Tregs有关,在变应性疾病中存在调节性T细胞的功能低下,亦有研究显示致敏小鼠存在CD4+CD25+T细胞极化不足,且在变应性气道炎症中起重要作用。我们推测大剂量过敏原诱导T细胞不反应性可能与诱导Tregs极化有关。为此,本实验将进一步研究大剂量过敏原在体外对DC表面共刺激分子表达及诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞极化的作用。1材料和方法1.1微织构类型外接收剂鸡卵蛋白(OVA)(Sigma),小鼠CD4+T细胞分离柱(R&D),PE-Cy5-anti-mouseCD4、PE-anti-mouseCD25、FITC-anti-mouse-Foxp3、FITC-ratIgG2a、PE-Cy5-ratIgG2a、FITC-anti-mouse-CD11c、PE-anti-mouse-MHCII、PE-rat-IgG2a(eBioscience),PE-ratIgG2a、PE-anti-mouse-CD80、PE-anti-mouse-CD86、FITC-AmericanHamsterIgG、PE-anti-ratIgG1(Biolegend)。1.2两组ova的注射或雾化激发健康雌性Balb/c小鼠84只,4～6周龄,20.5～23.2g,由本校实验动物中心提供,随机分为两组:(1)致敏组:分别于第0、7、14天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液0.1ml(内含OVA50μg,Al(OH)31mg),第21～25天每天予1%OVA生理盐水溶液雾化激发30min。(2)对照组则用生理盐水代替OVA进行腹腔注射或雾化激发。每组各42只,共设6个浓度处理级,每浓度级用7只小鼠。1.3悬浮细胞培养DC的分离:最后1次激发结束24h后,脱颈处死小鼠,无菌开腹取脾,研碎并以200目钢网过滤,加RPMI1640完全培养基于37℃,5%CO2培养2h,振荡,弃悬浮细胞,冲洗3次,贴壁细胞加培养基继续培养16h,收集悬浮细胞即DC,调细胞数为5×105/ml。CD4+T细胞的分离:按前法收集脾细胞悬液,按说明书以CD4+分离柱分离得CD4+T细胞,调细胞数为1×106/ml。1.4致敏小鼠cd4+t细胞uOVA处理组加入终质量浓度为10mg/ml的OVA,致敏小鼠DC0.25ml(106/ml)及CD4+T细胞0.25ml(106/ml),37℃,5%CO2培养72h。对照组以生理盐水替代。1.5pe-大鼠igg和外包大鼠igg的制备收集正常对照小鼠、致敏小鼠脾脏DC及OVA或生理盐水处理后致敏小鼠脾脏DC,离心弃上清,PBS重悬细胞沉淀,调细胞数至1×107/ml,每个EP管中加入0.1ml细胞悬液,分别加入FITC-anti-CD11c1μg及PE-anti-CD801μg、PE-anti-MHCII1μg或PE-anti-CD861μg做双染色,同型对照管中分别加入相应PE-大鼠IgG和FITC-仓鼠IgG,4℃避光孵育30min后,离心弃上清,PBS洗涤2次后,重悬为0.3ml,立即上机检测。1.6pe-cy5-cd4和fic-大鼠igg的制备收集正常对照小鼠、致敏小鼠脾脏CD4+T细胞以及OVA或生理盐水处理后致敏小鼠脾脏CD4+T细胞,离心弃上清,PBS重悬细胞沉淀,调细胞数至1×107/ml,每个EP管中加入0.1ml细胞悬液,分别加入PE-Cy5-anti-CD41μg、PE-anti-CD251μg以及FITC-anti-Foxp31μg染色,同型对照管中分别加入相应PE-大鼠IgG和FITC-大鼠IgG,4℃避光孵育30min后,离心弃上清,PBS洗涤2次后,重悬为0.3ml,立即上机检测。1.7统计处理数据以均数±标准差表示,用SPSS10.0进行单因素方差分析及相关性分析。2结果2.1小鼠血清中表达、正常对照小鼠的表达按本法分离小鼠脾脏DC的CD11c阳性率为82.88%左右,纯度较高。致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ表达分别为38.12%、67.44%、90.41%,正常对照小鼠为27.66%、46.62%、62.02%。2.2大剂量过敏原对DC表面分子表达的作用10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达分别由35.46%±6.76%、67.83%±5.72%减少至21.94%±5.00%、44.36%±3.44%(P<0.05),见图1、图2。2.3cd4+cd25+t细胞对小鼠脏器细胞中cd4+cd5+t细胞的表达FACS结果提示,正常对照小鼠脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞所占百分率为(5.08±1.01)%,致敏小鼠脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞所占百分率为(2.02±0.79)%,两者之间有显著差异(P<0.05)。2.4+长期氧合酶5和前期ccp3+t细胞所占百分率10mg/ml的O-VA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞所占百分率由(2.22±0.92)%上升至(5.20±0.81)%,差异显著(P<0.05)。Tregs的比例可以恢复到正常对照的水平,见图3、图4。3大剂量中国特色社会主义免疫治疗的可能路径选择树突状细胞(DC)是体内功能最强大的抗原呈递细胞,是机体对外界“无害”抗原产生免疫耐受的重要的调控者。不同成熟阶段的DC对机体发生免疫应答的命运,即诱导免疫反应还是免疫耐受也有重要的影响。未成熟DC表面MHCII抗原及共刺激分子表达较低,主要诱导T细胞的免疫耐受。成熟DC表面这些分子的表达水平较高,主要诱导CD4+T细胞向Th2细胞分化。本研究用流式方法检测脾脏DC表面分子发现,致敏小鼠DC表面MHCII、CD80及CD86水平明显高于正常对照小鼠。所以,致敏小鼠DC主要诱导Th2反应;而正常对照DC则不能导致T细胞活化,表现为对OVA的刺激无反应。CD4+T细胞的活化另一必需条件是APC提供共刺激信号(第二信号)。其中,表达于多种APC表面的B7-1(CD80)、B7-2(CD86)在Th2型免疫反应中占重要地位。T细胞活化的需要两个主要共刺激通路,依赖于T细胞表面的CD28和CD154(CD40L)分别与DC表面的CD80/CD86和CD40相互作用。一旦活化,T细胞表达CD152(CLTA-4)-CD28类似物,与CD80/CD86连接比CD28有更高的亲和力,抑制IL-2产生、IL-2受体的表达、活化T细胞的增殖。阻断这些共刺激通路对自身免疫性疾病和同种异体抑制物排斥有益,可以诱导免疫耐受。DC活化幼稚性T细胞的独特能力与MHC和共刺激分子表达升高有关。因此,阻断共同刺激信号通路或诱导DC具有免疫耐受特性成为过敏性疾病和哮喘的免疫治疗的主要目标。研究发现下调DC表面共刺激信号CD86产生免疫耐受。本文结果显示,大剂量过敏原体外处理DC可下调致敏小鼠脾脏DC表面CD80、CD86表达,提示共刺激分子的表达不足可能是T细胞不反应性的诱因之一。大剂量过敏原可能通过影响DC表面共刺激分子表达来诱导免疫耐受。调节性T细胞是CD4+T细胞的亚群,但尚没有独特的分化标志,过去主要将CD4+CD25+作为其主要的细胞标志。近来发现Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞特异性标志。RT-PCR和蛋白电泳结果均显示Foxp3仅在CD4+CD25+Tregs细胞表达10。Foxp3参与了Tregs在胸腺的发育,它在CD4+CD25+Tregs组成性表达是该细胞发挥功能的前提。此外Foxp3还可能具有诱导小鼠体内静止的CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+T细胞转化的功能。正常对照小鼠来源的CD4+CD25+Tregs,阻断其Foxp3的表达后,细胞表面CD25、CD45RB、CTLA-4及GITR等表面分子下调,其抑制功能亦明显低下。哮喘Th2细胞的过度活化和增殖可能与调节性T细胞对其抑制不足有关。在哮喘中可能存在Tregs分化诱导机制的障碍。本实验结果显示,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量远低于正常对照小鼠,提示Tregs的数量不足可能是哮喘免疫耐受机制缺陷的一个关键环节。Tregs的具体分化机制目前尚不清楚。诱导外周T细胞耐受是SIT的关键环节,这种耐受主要依靠诱导Tregs产生来抑制对过敏原的增殖反应和细胞因子分泌。对蜂毒(BV)过敏患者进行BV及蜂毒主要过敏原PLA12的SIT、对Derp113进行的SIT及变应性鼻炎患者进行的SIT均证实了这一点。Ostroukhova等通过反复小剂量OVA刺激建立过敏原耐受模型诱导出OVA耐受小鼠,其Th2细胞因子受抑,IgE水平显著降低,该小鼠体内所分离的CD4+T细胞在体内体外实验中均显示其抑制活性,耐受小鼠CD4+T细胞CD25及Foxp3表达均显著增加。这些都提示我们SIT所诱导的外周耐受与Tregs的极化密切相关。本实验中我们发现大剂量过敏原体外处理可诱导Tregs极化,提示我们大剂量过敏原可能通过此途径修复哮喘免疫耐受机制的“缺陷”。在目前SIT治疗中存在着疗程长,疗效不理想等