亚低温对惊厥性脑损伤的保护作用

亚低温对惊厥性脑损伤的保护作用

痉挛是儿童常见的疾病，发病率为3%4%，其中20%是反复发作性痉挛和痉挛状态的患者。惊厥反复发作或持续状态可导致脑损害,组织病理上,可表现为神经元坏死、细胞凋亡、胶质细胞增生及海马硬化。如何对惊厥性脑损伤进行神经保护是目前临床需解决的重要问题。亚低温(33～35℃)在新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)脑保护的研究表明,其具有神经保护的作用。主要通过降低脑代谢、减少炎症介质和过量兴奋性神经递质的脑损伤及抗凋亡作用来实现。而惊厥的产生、维持与体温有相关性。动物实验中,低温(30℃)情况下,惊厥较难发生,且维持时间短,海马损伤较轻。但惊厥产生脑损伤后予亚低温干预是否具有神经保护作用目前尚无报道,本实验就此进行研究。开孔后典型各模型的建立动物清洁级健康雄性Wistar幼鼠(出生18～21日龄)60只(本校动物实验部提供)。仪器低温箱:外径长41cm、宽29cm、高17cm,内径长28cm、宽21cm、高17cm,其间放入1500g冰块,使箱内温度维持于6～8℃;OMEGA450AET温度探针,探针直径0.127mm。惊厥持续状态(SE)模型的制作和分组幼鼠随机分成正常对照组8只和毛果芸香碱(pilocarpine)组52只。正常对照组给予生理盐水50mL/kg,腹腔注射。毛果芸香碱(上海生物医药公司提供)组按150～180mg/kg剂量(100mg毛果芸香碱溶于5mL生理盐水)腹腔注射。该组用药后观察有无惊厥发作,惊厥组按Racine6级评定,将惊厥发作分为0～Ⅴ级。0级:无任何发作迹象;Ⅰ级:凝视、咀嚼和须动;Ⅱ级:点头或湿狗样抖动、搔抓;Ⅲ级:前肢局限性阵挛;Ⅳ级:伴后肢站立的全身强制性发作;Ⅴ级:伴有站立并摔倒的全身强直-阵挛性发作。Ⅳ级和Ⅴ级发作为全身性惊厥或大发作;持续30min以上的大发作即为本组SE模型。其中28只造模成功。SE模型鼠随机分成惊厥组和亚低温干预组(亚低温组)。亚低温干预惊厥后30min将幼鼠置入低温箱,监测其肛温和鼓膜温度,使之维持在33～35℃,连续3d,自由摄食。免疫组化染色麻醉、灌注、切片干预后72h,经水合氯醛麻醉,生理盐水快速经左心冲洗2min后,即予4%多聚甲醛灌注5min,断头取脑,再行后固定于灌注液24h,常规石蜡包埋。从视交叉处开始作冠状连续切片,片厚5μm,取含有背侧海马最大断面的切片,每例幼鼠分4套分别行HE染色、TUNEL(TerminaltransferasedUTP-NickEndLabelling)、GFAP(神经胶质原纤维酸性蛋白)和caspase-3(cysteine-contai-ningaspartate-specificprotease)免疫组织化学染色。TUNEL石蜡切片经常规二甲苯脱蜡至水,采用美国Roche公司试剂盒,DAB显色。GFAP和caspase-3免疫组织化学染色石蜡切片经常规二甲苯脱蜡至水,均采用美国LABVISION公司Envision法试剂盒,DAB显色。一抗稀释浓度均为1∶200。显微镜下计数HE染色重点观察海马CA1、CA3区神经元改变。从每只鼠的切片中任选一张,在海马CA1、CA3区各选取相似部位,在同一高倍(400倍)视野下,计数两高倍视野神经元细胞,计算坏死神经元在总细胞数中百分比。免疫组化切片在图像分析仪同一高倍视野下行单位面积阳性染色面积百分比或阳性细胞计数。统计分析数据以表示,采用SPSS11.5统计软件进行方差分析。结果亚低温干预前后海马gfap阳性细胞的变化正常鼠神经元细胞核大而圆,位于细胞中央,异染色质少,似空泡状,呈淡蓝色,中央有一清楚核仁;胞质呈淡红色,多有突起。SE鼠脑组织切片出现明显神经元变性、死亡。表现为核染色质碎裂、核仁消失、核溶解;胞质空化或浓缩变暗,整个神经元体积缩小,胞膜皱缩,呈三角形或不规则形,最终整个细胞可呈均匀一致的红色。神经元周围出现空隙。病变以海马CA3区最明显,CA1区、齿状回及颞叶皮质亦可见到病变神经元。亚低温干预组坏死神经元较惊厥持续状态组明显减少(表1,图1a、b、c见封三)。正常对照组海马区可见少量淡染的棕色细胞,胞体小、突起短而少,染色浅。SE组海马区可见大量浓染的GFAP阳性细胞,胞体肥大、突起密集、相互交织。亚低温组GFAP阳性细胞较SE组减少,胞体缩小,突起密度降低(表2,图1d、e、f见封三)。SE组海马区可见典型凋亡细胞形态改变,表现为有明显的染色质聚集、胞质浓缩、细胞核皱缩、周围空泡形成及单个圆形凋亡小体。而正常对照组和亚低温干预组TUNEL阳性细胞较少(表3,图1g、h、i封三)。SE组海马区可见到较明显DAB显色阳性细胞,而正常对照组和亚低温干预组DAB显色阳性细胞较稀疏(表4,图1j、k、l封三)。亚低温干预对惊厥性脑损伤的保护作用毛果芸香碱致痉模型是常用SE动物模型,与人类癫癎有许多相似之处。毛果芸香碱是M1、M2胆碱受体激动剂,在啮齿类动物中经全身注射可导致抽搐发作。其致痉作用可能是通过改变离子通透性和第二信使发挥。电生理研究发现主要作用于Ca2+电流、兴奋性突触后电位和改变K+通透性。这些改变可导致脑内神经元兴奋性增高。Cruickshank等通过采用乙酰胆碱受体激动剂卡巴发现M1受体优先参与了惊厥的发生,M1受体活化导致三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯形成。惊厥持续状态可导致海马锥体细胞坏死、凋亡,海马硬化苔藓状纤维出芽神经元过度兴奋,改变GABAA受体功能。凋亡蛋白酶(caspase):是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。caspase在凋亡中的主要作用是:灭活细胞凋亡的抑制物;水解细胞的蛋白结构,导致细胞解体,形成凋亡小体;在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白,从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。caspase-3是细胞凋亡共同通路的关键蛋白酶。因此本实验将caspase-3作为检测凋亡途径的蛋白。本实验发现亚低温干预对于惊厥性脑损伤具有保护作用,减少神经元坏死,特别可减少CA3区锥体细胞坏死,缓解胶质细胞增生,抑制细胞凋亡。亚低温干预对脑外伤、缺氧缺血性脑病的保护作用已逐步得到证实。脑保护作用机制与降低脑细胞氧代谢率、改善细胞能量、在脑外伤和缺氧缺血性脑病中,均证实亚低温可抑制细胞外过量兴奋性神经递质谷氨酸的释放,从而减轻脑损伤。而惊厥性脑损伤的发生与过量的兴奋