青藏高原青藏高原旱趾旱趾遗传多态性研究

青藏高原青藏高原旱趾旱趾遗传多态性研究

干旱的物种属于母乳纲、蠕虫、老鼠和干旱的动物。世界上确定了14种干旱动物，其中四种分布在中国。喜马拉雅干旱鼠、西伯利亚干旱鼠、灰干鼠和尾干旱鼠。喜马拉雅旱獭是我国分布最广、数量最多的旱獭种类,主要栖息在海拔2800～4000m的青藏高原。青藏高原特殊的地理环境造就出喜马拉雅旱獭独特的生物学特性。喜马拉雅旱獭作为青藏高原主要的生态动物之一,因耗氧量低,可用于高原生理、低氧环境下动物生理及人类高山病病理生理学的研究。此外,旱獭也被广泛应用在人类乙型肝炎病毒感染、冬眠、动物生态系统维持、进化等方面的研究。笔者以前的研究表明,喜马拉雅旱獭可自然感染旱獭肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus,WHV),某些地区的喜马拉雅旱獭对WHV更是高度敏感,可用于人类乙型肝炎和丁型肝炎的研究;与此同时,笔者也发现喜马拉雅旱獭携带脂蛋白,能够抵抗高胆固醇饲料诱导的动脉粥样硬化,它可被用于人类心血管疾病的研究。为了更好地确定不同地区喜马拉雅旱獭的遗传结构,笔者利用13个微卫星位点(microsatelliteloci)对青海省同仁县、乌兰县和玉树县等3个喜马拉雅旱獭地理种群的遗传多态性进行了检测。微卫星标记技术具有分布广泛、多态信息含量高、检测方便等特点,是研究物种遗传多态性的重要工具,同时也被应用于旱獭的遗传结构的研究。本试验的初步研究结果表明,同仁、乌兰和玉树这三个区域的喜马拉雅旱獭种群存在高度的遗传多态性,且3个种群之间存在明显的遗传差异。该研究结果为人们了解青藏高原地区野生喜马拉雅旱獭的遗传资源以及利用旱獭模型进行生物医学研究提供了重要的信息。1材料和方法1.1研究对象的选取在2009-2010年间,笔者选取青海省3个地理种群的99份喜马拉雅旱獭尾部标本(包括毛发、肌肉、骨骼,置于阴凉处晾干)作为试验研究对象,标本分别来自青海省同仁县(E:102°20′,N:35°52′;标本数n=50)、乌兰县(E:98°48′,N:36°93′;n=28)和玉树县(E:97°02′,N:33°00′,n=21)。1.2pcr扩增采用过柱法提取旱獭尾部组织基因组DNA。DNA提取试剂盒(D3096-02)由Omega公司提供(OmegaBio-TekInc.Norcross,GA,USA)。旱獭基因组DNA的提取方法按照试剂盒说明操作:用含蛋白酶K的裂解液处理旱獭尾部标本,裂解产物过柱、吸附基因组DNA,再用蛋白洗脱液、去离子水洗脱,可得到纯化DNA。PCR反应体系:北京天根生化科技有限公司提供的PCRMasterMix(KP201-01)。在本次试验中,笔者选择了13对针对旱獭微卫星位点的引物分析青海省三个生态区域的喜马拉雅旱獭种群的遗传多态性,其中8对引物序列来源于喜马拉雅旱獭,其他5对引物序列来源于欧洲旱獭,这13对引物序列见表1。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。PCR扩增体系的总体积为25μL:8.5μL去离子水,2μL模板DNA(浓度10ng/μL),2μL引物(正向和反向引物各1μL,浓度均为10μmol/L),12.5μL2×MasterMix(0.1UTaq聚合酶,500μmol/LdNTP,20mmol/LTris-HCl,100mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2)。PCR反应条件:94℃预变性10min;94℃变性60s,55℃退火60s,72℃延伸90s,循环40次;72℃延伸10min。4℃保存。热循环仪(EDC-810)由北京东胜创新生物科技有限公司提供。1.3电泳的银染对PCR扩增产物用120g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,电压120V,电泳时间90min,电泳结束后按照文献所述方法进行银染。银染方法如下:把PAGE胶先用冰醋酸固定10min、蒸馏水洗3次后,用硝酸银染20min、蒸馏水漂洗5s,再用染液(含甲醛、碳酸钠、硫代硫酸钠)染色4min,最后用75mL/L冰醋酸终止反应。然后照相、分析。1.4遗传多样性co-关于用POPGEN32软件进行种群遗传分析,统计整个群体及各群体的等位基因频率、等位基因数(allelenumber)、有效等位基因数(effectiveallelenumber)、基因多样性即杂合度(genediversity)、Shannon指数(shannoninformationindex)等参数,估计种群的遗传多样性。根据Botstein等报道的公式计算各位点的多态信息含量(polymorphisminformationcontent)。利用等位基因频率计算标准遗传距离和遗传相似系数,再聚类分析做出邻位相连法(neighbor-joiningmethod)和除权配对法(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages)系统发育树。2系统发育树的构建喜马拉雅旱獭基因组DNA微卫星位点的PCR扩增产物的电泳银染结果见图1。13个微卫星位点在3个喜马拉雅旱獭群体中共检测出129个等位基因,平均每个位点的等位基因数是9.9231,有效等位基因是82.0481,占63.60%。各位点有效等位基因数范围为3.5953～8.2139,平均值为6.3102。平均杂合度和Shannon指数范围分别为0.7219～0.8783和1.4728～2.2287,平均值为8.2139和0.8783。通过对比研究,笔者发现玉树县喜马拉雅旱獭的杂合度最低(0.7602),同仁县种群的杂合度最高(0.8207)。玉树县喜马拉雅旱獭的Shannon指数最低(1.6467),同仁县喜马拉雅旱獭的最高(1.9111)。结果详见表1。利用等位基因频率,笔者计算了3个喜马拉雅旱獭种群之间的遗传相似系数和标准遗传距离。结果显示,青海省3个喜马拉雅旱獭群体的遗传相似系数和标准遗传距离范围分别为0.7159～0.8037和0.2186～0.3342。同仁县与乌兰县、同仁县与玉树县、乌兰县与玉树县之间的遗传相似系数分别为0.8037、0.7159、0.7599,标准遗传距离分别为0.2186、0.3342、0.2746。利用邻位相连法和除权配对法,笔者制作出了喜马拉雅旱獭3个种群的系统发育树(见图2)。从图2看出,玉树县的喜马拉雅旱獭与同仁县旱獭、乌兰县旱獭的遗传背景差异较大,而同仁县旱獭与乌兰县旱獭的遗传背景较为相似。3不同地理种群的遗传多样性喜马拉雅旱獭是青藏高原特有的动物种群。由于青藏高原海拔差异较大,多种特殊地理地貌阻隔,导致不同区域旱獭的遗传结构出现差异。为了深入了解青藏高原不同区域喜马拉雅旱獭的遗传背景,分析不同区域喜马拉雅旱獭对WHV敏感性差异的原因,笔者利用13对微卫星标记引物对青海省3个区域喜马拉雅旱獭的遗传结构及其遗传关系进行了分析。微卫星DNA是基因组中短串联核苷酸重复序列,核心序列2～6bp,在真核基因组呈均一性分布,与其他DNA分子标记(例如RFLPs、AFLPs以及RAPDs)相比,微卫星DNA具有高可变性和共显性优势。此外,微卫星DNA侧翼序列在同一物种中一般都是保守的。因此,可针对微卫星侧翼DNA序列设计引物,PCR扩增包含微卫星序列的DNA片段,用来分析一个种群的遗传多态性。微卫星标记也被应用在旱獭种群的遗传多态性研究中,如Goossens等、Silva等利用微卫星标记分析了高山旱獭(Marmotamarmota)种群的遗传多态性;Hanslik等筛选了高山旱獭和地松鼠(Spermophiluscitellus)的微卫星位点,并分析了其种群的多样性;Kyle等筛选出灰白旱獭(Martmotacaligata)微卫星位点并用这些微卫星标记对灰白旱獭、地松鼠种群的遗传结构、交配系统、物种进化等进行了研究。徐金会等从青藏高原4个不同区域(德里、乌兰、沱沱河和安多)喜马拉雅旱獭种群中筛选出8个高度变异的微卫星位点,分析了喜马拉雅旱獭的遗传多样性。在本研究中,笔者从Silva等进行欧洲高山旱獭研究采用的16个微卫星位点中筛选出5个微卫星位点,并采用徐金会等研究喜马拉雅旱獭的8个微卫星位点,共计13个微卫星位点,以此为基础设计了PCR扩增引物,开展了青海玉树、同仁、乌兰3个区域喜马拉雅旱獭微卫星DNA多态性的研究。评估遗传多样性的重要指标包括有效等位基因数、杂合度、Shannon指数、多态信息含量等。有效等位基因数反映各等位基因的相互影响,它代表种群多态性。杂合度即基因多样性,代表种群的遗传变异和一致性程度。杂合度大于0.5说明遗传多样性水平较高;否则,遗传多样性水平较低。Shannon指数容易受到选择突变和遗传漂变方面影响,Shannon指数越大,遗传多样性就越大,反之遗传多样性就越小。多态信息含量是多态性片段的一个指数。基因位点多态信息含量大于0.5表明多态性高,在0.25和0.5之间是中度多态性,低于0.25为低度多态性。在本研究中,喜马拉雅旱獭有效等位基因数已接近每一个位点等位基因的数目,微卫星位点呈现良好的遗传多样性。与此同时,平均每个位点的等位基因数是9.9231,高于一般的种群,所以这3个地理种群喜马拉雅旱獭都具有较高的遗传多态性,每个种群平均杂合度均大于0.5。Shannon指数大于1.3701,说明这3个地理种群旱獭的遗传背景比较复杂,容易受到外部环境的影响。遗传距离反映不同种群或物种的差异程度。而遗传一致性指在不同的种群之间基因结构的相似性。遗传距离越小,则遗传一致性越高,表示种群的血缘关系越近。在本研究中,笔者计算了3个喜马拉雅旱獭种群的遗传距离和遗传一致性,而且在此基础上绘制了3个旱獭种群的系统发育树。结果表明,青海省3个喜马拉雅旱獭群体有明确的遗传关系,这3个旱獭种群分为两个分支:乌兰县旱獭和同仁县旱獭为一支;玉树县旱獭为另一支。这种种群分布与这3个县的地理地貌特点基本一致:乌