第六节-DNA的变性、复性

第六节DNA的变性、复性一DNA的变性(denaturation)DNA分子是由两条头尾倒置的脱氧多核苷酸所组成，其中一条链的碱基与另一条的碱基之间有氢键连接，并以A－T，G－C互补，整个DNA分子呈双螺旋结构。在加热、碱性等条件下，链间氢键断裂，形成两条单链结构，这种现象称为DNA变性（denaturation）。DNA在溶液中发生变性伴随着一系列的物理化学性质的改变,如紫外吸收强度的增加,此种现象称增色效应(hyperchromicity)；溶液粘度的降低；沉降速度增加等。这些物理常数常用来研究各种DNA结构和功能。对某一DNA来说，其紫外吸收强度(A260)是双链DNA单链DNA。紫外吸收强度的增加与变性(解链)程度成正比。若将A260的增加作为温度的函数作图，可得解链曲线(图2-18)。DNA的热变性常称为DNA的“融解”（melting），解链曲线的中点所示温度称为Tm或称为融点，Tm表示使50%DNA分子解链的温度。不同种类DNA有不同的解链曲线，也有不同的Tm，Tm随G+C%含量呈线性增加(图2－19)。每增加1%G+C含量，Tm增加约0.4℃，这是由于G/C碱基对之间的氢键多于A/T对之故。溶液的离子强度Tm有较大的影响，单价阳离子浓度每增加10倍，Tm增加16.6℃。某些化学试剂能显著影响Tm值，例如甲酰胺能破坏氢键，图2-18DNA变性过程和变性曲线图2-19GDNA在变性过程中，其分子量不变，但二级结构中的氢键破坏，在双螺旋解旋分离为两条链的过程中，一级结构中的共价键都不破坏。DNA变性有两个阶段，第一阶段部分解链，已解开部分不规则卷曲；第二阶段为完全解开，形成两条单链，此时若迅速泠却，每条链自身卷曲，部分区域形成链内双螺旋（见图2-20）。第一阶段变形可以逆转，即当温度降低时，已解开的链又会重新盘绕，形成完整的天然双螺旋。第二阶段DNA双链完全分开，很难恢复到天然构型。图2-20DNA热变性过程轻度变性，往往只有A-T分开，G-C不分开，富含A-T的区域就形成小“泡”，富含G-C区域保持双链结构，在电镜中可以可以观察到这种结构，从而推测DNA的结构特征（见图2-21）。已变性的DNA，若两条单链硷基组成不同，嘌呤比例高低不一，分子量和分子密度也就不同，所以可以用密度梯度离心或电泳法将变性后形成的两条单链分离开来。图2-21电子显微镜下的DNA分子的部分变性二DNA复性(renaturation)在去除变性条件下，两条变性的碱基互补的单链DNA可以恢复成双链结构，恢复原有的物理化学特性和生物学活性,这种现象称为DNA复性(renaturation）,或称为退火（annealing）。影响变性与复性过程的主要因素是温度、DNA浓度、复性时间和盐浓度、变性剂浓度。与两条链之间碱基互补的程度当然更有关系。复性的最适宜温度是Tm下25。C，在这温度下不易发生硷基错配和链内硷基配对，如果，加热变性后将变性DNA立即置于冰中，会仍然保持变性状态。一般来说，DNA浓度愈高，复性愈快，因为在一定时间里，互补的单链DNA发生碰撞的几率愈高。时间愈长，发生复性愈多。高盐浓度易于复性，有变性剂存在下，不易复性。一般来说，DNA浓度越高，两条互补单链相遇的几率增加，复性的速率就增加。图2-23真核基因DNA复性动力学第二阶段的组分叫中速复性组分，占总DNA的30%，Cot值在0.2～100之间，Cot1/2为1.9。第三阶段的组分叫慢复性组分，占总DNA的45%，Cot范围在100～10000之间，Cot1/2为630。为了计算这些组分的复杂性，每一种都得以独立的动力学组分来处理，即单独与标准DNA进行比较。慢复性组分占总DNA的45%，那么它的C0就是0.45，其Cot1/2就是0.45×630=283。假定在相同条件下，大肠杆菌DNA的复性反应的Cot1/2是4，，复杂性是4.2×106bp，将各项值代入（5）式，那么4.2×106bp×283慢复性DNA的复杂性=--------------------=3×108bp4用相同的方式处理其余两个组分4．2×106bp×1.9X0.3中速复性的DNA复杂性=--------------------=6×105bp44．2x106bpX0.0013X0.25快速复性的DNA复杂性=--------------------------=340bp4从上面结果可见，一个组分复性愈快，其复杂性就愈小。从非重复顺序DNA的复杂性可以估计出基因组大小。慢复性组分的复杂性相对应于它物理上的大小。假定图2－22中的基因组用化学方法测出其单倍体DNA含量为7×l08bp，那么它的45%就是3．15×l08bp，这同比用动力学方法测得的数值稍大了一点（3×l08bp），但可以看作是相同的。因此，可以说慢复性组分的复杂性无论是用化学方法，还是用动力学方法测定，得到的结果都是相同的。用化学方法恻得的数值叫化学复杂性，用动力学方法测得的数值叫动力学复杂性。这两个数值的一致性意味着慢复性组分含有的DNA顺序在基因组中都是唯一的，即是非重复顺序。在变性以后，每一个单链仅能同它相互补的单链进行复性，在原核细胞中几乎都是唯一的，而在真核细胞中通常不是唯一的，只是占大多数，这部分DNA叫非重复顺序DNA。我们能用非重复顺序DNA的复杂性估计出基因组的大小。例如非重复顺序DNA的复杂性为3×l08bp，这部分DNA占总DNA量的45%，那么，3.0×l08bp×0.45=6.6×108bp，这就是基因组的大小。这就提供了另一个独立的方法来估计基因组的大小。这同化学方法测定的结果（7.0×l08bp）是非常接近的。用动力学测定的复杂性对用化学方法测定的单倍体DNA含量作图，结果非常一致，表明非重复顺序DNA组分都是由在基因组中仅有一个拷贝的DRA顺序组成。在基因组中存在多于一个拷贝的顺序叫重复顺序，仅有一个拷贝的叫非重复顺序。正常情况下，重复频率由下式决定化学复杂性重复频率（f）=-------------------动力学复杂性重复顺序DNA包括所有重复频率显著大于1的组分。例如某一基因组是由单拷贝的Abp长、10个拷贝的Bbp长和100个拷贝的Cbp长三部分组成，其复杂性就是A＋B＋C，其重复频率分别为1、10和100。AbP是非重复顺序，Bbp和Cbp是重复顺序。重复频率1与2之间也属于非重复顺序。从前面提到的例子来看，化学复杂性是3.15×l08bp，动力学复杂性是3.0×l08bp，f=3．15×l08bp/3．0×l08bp=1.05,所以是属于非重复顺序。解离的核酸互补链，重新形成碱基配对的螺旋结构的复性速度取决于下列四个参数：正离子浓度正离子作为反离子减少两条互补链的磷酸