黄精多糖提取纯化工艺的优化及其薄层鉴别方法的研究

黄精多糖提取纯化工艺的优化及其薄层鉴别方法的研究

黄精是中国传统的药物和食品中药。具有益气健脾、润脾、健肝、补肾的功效。黄精多糖是黄精的主要活性成分之一,由葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸等组成,具有降血脂、降血糖、增强记忆、抗病毒和增强肌体免疫力等药理作用。目前黄精多糖的提取多采用热水浸提工艺、超声提取、微波提取等。本研究以黄精多糖提取率为评价指标,采用正交实验设计,优选黄精多糖的提取工艺,并建立黄精多糖的薄层鉴别方法,为黄精资源的进一步开发利用和中药新药产品开发奠定基础。1测定试材的选择UV957S紫外-可见分光光度计(上海精密科学有限公司);电子天平(岛津国际贸易有限公司,型号AUX220);蒽酮等试剂均为分析纯。黄精药材、桔梗药材(购于成都荷花池药材市场,经四川省中医药科学院方清茂副研究员鉴定为中国药典2005版一部收载品种);D-无水葡萄糖对照品(批号110833-200503)、黄精对照药材(批号121341-200402)、桔梗对照药材(批号121028-200608),以上对照品和对照药材均购于中国药品生物制品检定所。2方法和结果2.1提取工艺正交试验2.1.1因素水平水提取方法的主要影响因素为提取次数、提取时间、料液比。在单因素试验的基础上,进行三因素三水平设计,见表1。2.1.2乙醇醇沉的制备采用L9(34)正交表,空白列为误差项,进行正交试验。称取药材25.00g,共9份。分别按正交实验表所列提取次数、提取时间、溶剂倍数加热提取,抽滤,滤液浓缩至25mL,冷却,搅拌下缓慢加入95%乙醇醇沉至80%。静置过夜,抽滤,得沉淀9份,备用。2.1.3提取次数和提取时间对多糖提取率的影响取上述9份沉淀分别加蒸馏水溶解并转移至250mL容量瓶中,加入蒸馏水至刻度,定容,摇匀。精密量取0.5mL溶液于100mL容量瓶,加入蒸馏水至刻度,定容,摇匀。精密量取上述溶液各0.5mL,分别置10mL具塞干燥试管中,照中国药典2005版一部黄精含量测定标准曲线的制备项下的方法,依法测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg),计算,即得。实验结果及分析,见表2、3。由方差分析结果可见,A提取次数对多糖提取率有显著性影响,C溶剂倍数有一定影响,B提取时间则对提取的结果无明显影响。结合正交试验因素水平影响结果,确定的最佳工艺条件为A2B3C2,即提取2次,加8倍量水提取,每次1h。2.1.4黄精多糖的含量取黄精药材3份,根据筛选得到的优化设计,对其进行验证,黄精多糖的含量分别为33.56%,33.74%,33.45%.平均含量为33.58%。2.2醇沉试验2.2.1水平设计中的因素影响醇沉的主要因素有醇沉浓度、浸膏浓缩程度(药材浸膏比)、醇沉次数等因素的影响。因素水平设计见表4。2.2.2乙醇沉对多糖提取率的影响取黄精450.0g,加水3600mL水煮提取2次,每次1h,抽滤,合并滤液,平均分为9份(每份相当于药材50g),分别按照因素水平表和正交实验表所列实验参数,浓缩至不同程度,冷却,搅拌下缓慢加入95%乙醇沉至不同浓度,并按要求醇沉1～3次后,静置过夜,抽滤,沉淀置真空干燥箱55℃减压干燥,称重,计算多糖提取率(按药材质量计)。分别称取提取物适量加蒸馏水溶解并转移至100容量瓶中,加入蒸馏水稀释至刻度,定容,摇匀,备用。方差分析表明,B浸膏浓缩程度对多糖提取率有显著性影响,为最主要因素,C醇沉条件有显著性影响也为主要因素,A醇沉浓度没有影响,为次要因素。结合正交实验结果,较好的黄精醇沉工艺条件为B3C2A3,即浓缩程度为药材浸膏比1:0.7,醇沉浓度选为80%,醇沉次数为1次。2.2.4黄精多糖的含量取黄精药材3份,根据筛选得到的优化设计,对其进行验证,黄精多糖的含量分别为39.54%,39.72%,39.88%,平均含量为39.71%。2.3选择和识别黄精中的薄膜识别2.3.1热回流造林,制备成溶液取黄精2g,加入70%乙醇10mL,加热回流1h,过滤,滤液挥干,残渣用10mL丙酮溶解,过滤,滤液挥干,残渣用0.5mL丙酮溶解,转溶至1mL容量瓶中,备用。2.3.2黄精、对照材料和薄膜样品的制备取黄精对照药材2g,照黄精薄层样品制备法制备。2.3.3确定展开剂系统以硅胶G-0.7%CMC-Na为吸附剂,以10%磷钼酸乙醇液为显色剂,分别筛选三个展开剂系统:环己烷-乙酸乙酯-丙酮3:1:1,环己烷-氯仿-甲醇4:1:0.5,氯仿-丙酮4:1。结果展开剂氯仿-丙酮4:1,分离出的斑点多、分离效果好,确定其为最佳薄层层析条件。2.3.4不同展开剂的对比实验结果以0.7%CMC-Na硅胶G为吸附剂,氯仿-丙酮4:1为展开剂,10%磷钼酸乙醇液喷后于105℃烘烤至显清晰斑点。结果见图1。从以上薄层层析结果显示,黄精药材与黄精对照药材在相同Rf值有相同颜色、相同形状的斑点,黄精药材符合要求。2.3.5黄精的成分、重量2.3.5.1.黄精薄膜样品的制备2.3.5.阴性种粒剂的制备通过复方颗粒剂大量薄层试验,证实复方中桔梗药材对黄精阴性薄层样品有干扰,因此,黄精阴性样品制备时需缺黄精和桔梗。取缺黄精、桔梗的处方各组成物,按制剂制备方法制成黄精阴性颗粒剂。取该样品0.12g,照黄精药材薄层层析样品制备法制备样品,即得。2.3.5.附剂的制备以0.7%CMC-Na硅胶G为吸附剂,以氯仿-丙酮4:1为展开剂,以10%磷钼酸乙醇液喷后于105℃烘烤显色至显清晰斑点。结果见图2。3黄精的筛选3.1通过正交实验优化的水煮提取工艺为:用8倍量水煎煮2次,每次1h;纯化最佳工艺为:醇沉浓度为80%,溶液浓缩程度至药材:浸膏比1:0.7,醇沉次数为1次。3.2黄精药材在2005版药典中未收载薄层鉴别项,故对其薄层条件进行了筛选,得出黄精的展开条件为氯仿-丙酮4:1,显色剂以10%磷钼酸乙醇液喷后于105℃烘烤至显清晰斑点。3.3关于阴性样品的考查在对成品的薄层鉴别发现桔梗对黄精阴性有干扰,故在阴性样品的制备应去掉干扰因素,最终得出可靠的薄层鉴别方法。2.2.3糖液中含无水葡萄糖含量的测定分别精