生长相关蛋白43的研究进展

生长相关蛋白43的研究进展

相关蛋白质43（growingasykot43，签名-43）是与神经发育、突变形成和可塑性密切相关的磷酸细胞蛋白。周围神经损伤后,其含量可增加20~100倍。因其是神经元生长发育的标志性蛋白质,并在神经损伤后修复及再生过程中作用关键,对其研究日渐增加,本文就GAP-43的研究进展及其与周围神经再生的关系作一综述。1与轴突生长相关的蛋白质的描述荷兰科学家A.B.Oestreicher等在研究脑内磷酸肌醇代谢时发现了一种蛋白激酶C(PKC)的底物蛋白,命名为B-50;美国的1个实验室用GAP-43描述1种与轴突生长相关的蛋白质;另有许多学者在不同研究中分别用不同的代号表示1种新发现的神经系统特异性蛋白质,如F1为海马神经元持久突触后电位相关的磷蛋白、PP46为一种神经元生长锥膜的主要磷酸化蛋白质、P57为神经元特异性的钙调素蛋白,而L.I.Benowitz等通过对这些蛋白质氨基酸顺序及其生化及免疫特性的分析,证明这些命名不同的蛋白质实际上是同一种物质,即神经系统特有的膜磷酸蛋白———GAP-43,后来被统一称为GAP-43或B-50。2分子质量酶根据已经克隆到的几种动物(如大鼠、小鼠、牛)和人的cDNA序列,不同物种间GAP-43的一级结构具有高度的同源性。大鼠的GAP-43由226个氨基酸残基组成,而人的GAP-43由238个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸残基占32%,等电点为4.3~4.5,相对分子量为43000。它只含有1个芳香族氨基酸残基,而Ala、Glu、Lys和Pro的含量极其丰富,二级结构以无规则卷曲为主,整个分子呈棒状,具有很强的柔韧性。氨基酸序列极富亲水性,而疏水性氨基酸极少,且缺乏膜结合位点,然而它却以可溶性和膜结合的形态存在。从细胞水平看,它在轴突生长锥的动态结构中含量极高,而在胞浆中含量较低。GAP-43依靠其分子氮末端的1个疏水基与质膜上的脂肪链形成共价键而结合在质膜的内表面疏水端。它是蛋白激酶C的主要作用底物,经其作用后被磷酸化,其第41位氨基酸残基是整个分子中唯一的蛋白磷酸化酶作用位点;其第42位的苯丙氨酸残基与钙调蛋白(钙调素)有高度的亲和力(以共价键结合)。在缺少钙的情况下,可优先与钙调素结合。另外,GAP-43的磷酸化使其与钙调素解聚,并且它还是磷酸肌醇代谢的调节物。3神经纤维在脑或髓剑化的表达GAP-43是一种神经系统特异性蛋白质,广泛分布于大脑、小脑、海马以及脊髓、背根神经节和自主神经系统。近年来有学者发现神经胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞均能表达GAP-43。发育中的脊髓和神经节GAP-43的分布及其含量可较成熟神经元高10~20倍,且主要位于生长锥膜。人早期受孕6周胚胎所有发育的神经系统均有GAP-43mRNA的表达,最高表达存在于分化神经元的区域,如皮层板内;出生后1周内达到高峰,随后在大部分脑区内迅速下降到成年的低水平。成年时只有少数“活跃”脑区仍保持较高的表达,这些区域有:大脑皮层、海马CA3区、嗅球、蓝斑、中缝核、迷走神经背核等,其中海马CA3区、嗅球终身都在分化。另外,在脑或脊髓,GAP-43的分布有与神经纤维髓鞘化呈反比的趋势。在无髓或低髓鞘化的区域,GAP-43的表达水平高,而在髓鞘化水平高的区域如脊髓白质及神经纤维则不表达。此外,从发育过程中也可见GAP-43的表达,如新生第5天的大鼠,脊髓髓鞘化刚开始在脊髓白质内可见有强烈而均匀的GAP-43mRNA信号;在出生后第12天,髓鞘化接近成年状态,表达就明显降低;在出生后第28天,髓鞘化已完成时,则降至成年水平。4q基序对ca2+和钙调素的调节作用GAP-43与膜骨架的关系及膜连接的作用。GAP-43最初在高尔基器内与神经元膜成分结合,以膜泡形式沿轴突以400mm·d-1的速度快速转运,最后多聚集于轴突突触前终末,然后通过其N端的疏水性片段紧密连接在神经终末质膜胞质面,其中第3、4位的半胱氨酸与生长锥膜进行的可逆性结合可能起了重要的作用,作为一种高度亲水性蛋白,GAP-43与膜结合的假想模型是其在与胞质蛋白和细胞骨架蛋白相互作用及与膜结合这2种形式间相互转换。质膜内表面的蛋白网状结构可决定轴突终末的形状、活动性和通路引导。在生长锥,GAP-43通过与组成网状结构的膜骨架蛋白如肌动蛋白、胞影蛋白等结合而影响突触前终末的生长状态。另外,它可促进F-肌动蛋白在生长锥的聚集,使生长锥在形态上更具活力,并抵抗其回缩。GAP-43与钙调素的关系。GAP-43是钙激活蛋白家族的一员,这类分子与钙调素的结合域是同源的,含有一“IQ”基序,可调节Ca2+流量及钙调素的效力。钙调素与GAP-43的“IQ”区相结合,而GAP-43的PKC磷酸化位点Ser41也在该区内,因此磷酸化GAP-43将破坏其与钙调素的结合。相反,GAP-43与钙调素结合时将抑制PKC在该位点的磷酸化。GAP-43与钙调素的亲和性是非Ca2+浓度依赖的:当Ca2+低水平时,GAP-43与钙调素紧密结合;当Ca2+进入细胞后水平增高时便释放钙调素。GAP-43作为钙调素的贮存库,在第二信使作用下释放钙调素,同时GAP-43磷酸化。钙调素的释放引起神经末端局部位点钙调素依赖的级联蛋白的快速激活,如激活钙调素激酶引起突触素等蛋白的磷酸化,激活钙调磷酸酶可引起GAP-43的去磷酸化和与钙调素的重新结合,从而形成1个反馈环。活化的GAP-43进一步与细胞骨架成分相互作用,调节神经末端的活力,进而改变细胞形态。GAP-43与磷酸化和去磷酸化的关系。尽管早已知道GAP-43是PKC在神经元内的一种重要底物,但GAP-43磷酸化与神经生长的作用到近年才渐趋明了。转基因鼠过表达假磷酸化蛋白能诱导伪足生长、细胞黏附和肌动蛋白重组,使海马中产生大量投射纤维;反之,过表达去磷酸化GAP-43的转基因鼠的细胞出芽就大为减少,表明PKC引起的GAP-43在Ser41的磷酸化促进细胞的生长和出芽。另外,磷酸化的Ser41能被连接于膜上的非Ca2+依赖性磷酸激酶,可溶性Ca2+/钙调素依赖性磷酸激酶和钙调磷酸酶去磷酸化,GAP-43磷酸化和去磷酸化共同参与对GAP-43活性的调节。此外,磷脂代谢与膜受体介导的跨膜信号传递等过程有关,GAP-43的磷酸化和去磷酸化可能对这些过程有重要的调节作用。有学者认为,NGF可能促使GAP-43在生长锥中磷酸化,转染人GAP-43cDNA的PC12细胞对NGF的敏感性增加10倍,突起再生作用显著提高。GAP-43在信号传递中的作用。钙调素和PKC均参与了第二信使过程,GAP-43在磷脂代谢和Ca2+信号传递中也起了重要的作用。在第二信使系统中,受体介导PIP2水解,产生DAG和IP3。DAG的主要作用是激活PKC,而IP3能诱发Ca2+由胞内Ca2+自钙储池释放,提高胞浆中游离Ca2+的浓度。磷酸GAP-43能抑制纯化PIP-PIP2激酶的活性,从而抑制PIP2产生,成为PKC和Ca2+代谢的反馈抑制剂。另外,PKC可由非PIP2途径激活,并使GAP-43磷酸化而抑制IP3依赖的Ca2+代谢,使胞内Ca2+处于低浓度水平,这对Ca2+起第二信使作用至关重要。此外,G蛋白三聚体Go和Gi在生长锥膜浓聚,并受神经递质、细胞-细胞连接和药物的激活而影响生长锥的活性。体外实验证明:GAP-43通过N末端的氨基酸作用于Go和Gi蛋白的α亚基而刺激GDP-GTP转换。5病理组织学检测GAP-43可促进神经元的生长、发育、神经再生及突触重建。在生长锥,GAP-43可促进F-肌动蛋白的聚集,使生长锥在形态上更具活力,并抵抗其回缩。大多数学者认为,发育初期GAP-43分布于胞体,随着突起的延长,其分布也趋向于突起,最后浓缩于生长锥,胞体内GAP-43水平较低。当生长锥延长相互接触时,GAP-43表达受到抑制,GAP-43的表达与轴突的生长变化一致;在胚胎时期,GAP-43的作用是促进神经元的生长、发育和分化;在成年则能促进损伤神经的再生及触突重建。另外,在生长中的神经轴突末端,特别是生长锥质膜处,GAP-43分布极为丰富,可占质膜总蛋白的1%,是含量最高的蛋白质之一,并在生长锥内一直保持高水平。运用反义寡核苷酸探针阻断GAP-43的表达,或运用抗体抑制GAP-43,均可阻碍轴突生长。敲除GAP-43基因的小鼠,轴突定向生长出现障碍,而GAP-43过度表达则促进轴突迅速生长、分化,且GAP-43可迅速随着神经纤维与靶器官的联系建立而逆转,即表达增加。单纯用药物阻断轴浆流动也可以造成GAP-43表达增加,提示GAP-43的表达升高不单可由损伤引起,推测GAP-43的表达受某种逆行信号的调控,对完整的成熟神经元逆行信号的作用是抑制其表达,而对发育中和受损的神经元来说,另一种逆行信号可诱导其表达,显然逆行信号的本质、组织来源和作用方式都是不同的。前者的信号可能是由效应器产生,通过逆行轴浆流动至胞体,而后者是在发育中的轴突或损伤断裂的轴突尚未与靶器官建立联系前,由损伤局部产生或由胞体产生后又返回胞体的信号刺激GAP-43的表达。哺乳动物周围神经成熟神经元的轴突受损后,轴突的延长和重建可被重新诱导,表现出与发育过程类似的反应,即轴突的再生与神经的修复。起初GAP-43仍位于胞体,随着细胞突起的延长而逐渐趋向外周,最后集中在生长锥。当神经元突起相互接触时,GAP-43的表达抑制;当周围神经受损后,神经元蛋白合成的变化是轴突再生所必须的。轴突生长所需的蛋白必须由胞体运送至轴突,分为快速和慢速轴运蛋白,而快速转运蛋白中有一种在神经受损后,其含量呈直线增加,即GAP-43。压榨大鼠坐骨神经后24h即能测出标记的GAP-43,14d后GAP-43的水平比正常高60倍,114d恢复到正常水平,而GAP-43mRNA于伤后16h便开始升高,24h升高2.5倍,48h升高10倍,37d降至正常。相应的蛋白质表达在受损后40h开始增加,6~20d达高峰,60d时仍维持在较高水平,以后逐步下降,10个月后恢复至正常水平。神经损伤后,背根节中GAP-43与mRNA的变化不一致。从量上看,蛋白低,mRNA高;从持续时间看,蛋白持续时间长,mRNA持续时间短。前者是因mRNA存在于胞体,蛋白在胞体合成后很快被转运到轴突所致;后者说明GAP-43mRNA的表达不仅受转录调节,而且受蛋白质半衰期因素的影响。