南五味子的薄层色谱鉴别研究

南五味子的薄层色谱鉴别研究

南五味子是木兰科植物的中药五味子schidandary。etwils。干燥成熟的水果与五味子s.还有一些属于复合科的水果。由于它们的化学成分类型和有效性存在显著差异，自2000年以来，《汉语法典》将南五味子（fluenticschidanar，nanwyu泽）和五味子（fluenticschidanar，wti泽）结合起来。但在现行药典标准中,南五味子仍采用与五味子完全相同的对照品(五味子甲素)和色谱条件进行薄层色谱(TLC)鉴别,缺少专属性和特征性;而且含量测定项下五味子酯甲的含量限度未按干燥品计算,不够准确;对炮制品醋南五味子仅规定了制法和性状特征。为了有效的鉴别和质量控制,本文以特征性成分安五脂素为对照品,建立了南五味子专属性的TLC鉴别方法;测定了水分和总灰分;以优化的HPLC色谱条件,测定了干燥品中五味子酯甲的含量;同时采用相同的方法系统建立了醋南五味子的质量标准,以期为南五味子质量标准的完善和提高提供参考。1药品、药材与试剂Agilent1100型高效液相色谱仪,DAD紫外检测仪,Hpcheme色谱工作站;SHANGPINGFA1004天平(上海天平仪器厂);ZX98-1旋转蒸发仪(中国科学院上海有机化学所);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);DL-360超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);SRJX-3-9箱式电阻炉(上海鼎奇实业有限公司),水分测定仪(上海同歆生物医药科技有限公司)。硅胶GF254薄层板(10cm×20cm,烟台市芝罘黄务硅胶试验厂);南五味子对照药材(批号121118-200502)、五味子对照药材(批号120922-200606)、五味子酯甲对照品(批号11529-200503)购自中国药品生物制品检定所;安五脂素、五味子甲素对照品为本课题组自制,经HPLC-ELSD检测,纯度均达到95%以上;10批次南五味子药材收集情况见表1,经笔者鉴定均为华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.的干燥成熟果实,凭证样本保存于本教研室;10批醋南五味子饮片由以上南五味子样品分别按相同醋蒸工艺炮制所得;HPLC所用甲醇、四氢呋喃为色谱纯,水为市售纯净水,其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.1tlc识别2.1.1南药、药物色谱法对照品试验取本品粉末1g,加环己烷10ml,超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,滤过,滤液蒸干,加入甲醇2ml溶解,离心(5000r/min)2min,取上清液蒸干,加环己烷1ml使溶解,作为供试品溶液。分别取南五味子对照药材、五味子对照药材各1g,同法制成对照药材溶液。再取安五脂素、五味子甲素对照品,分别加环己烷制成每毫升含2mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述5种溶液各2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以三氯甲烷-丙酮(60∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(254nm)下检视,南五味子供试品、南五味子对照药材和五味子对照药材色谱中,在与五味子甲素色谱相应的位置上,均显相同暗斑;在与安五脂素色谱相应的位置上,仅南五味子供试品和对照药材色谱显相同暗斑,但较模糊见图1a。将薄层板取出,再喷以磷钼酸试液,105℃加热至斑点显色清晰,南五味子供试品和对照药材色谱中,在与安五脂素色谱相应的位置上,显相同的深蓝色斑点;五味子对照药材色谱中,在与安五脂素色谱相应的位置上,仍无任何斑点见图1b。2.1.2供试品溶液色谱采用上述相同的方法对醋南五味子进行TLC鉴别,供试品溶液色谱中,在与南五味子对照药材和安五脂素对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。2.2测定项目及结果南五味子中含有丰富的挥发油,故水分测定采用《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录ⅨH水分测定法第二法(甲苯法)进行;总灰分测定按《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录ⅨK灰分测定法进行。10批药材及饮片的水分、总灰分测定结果见表2。根据测定结果,建议南五味子和醋南五味子的水分不得超过12.0%,总灰分不得超过6.0%。2.3hplc-南方公司的hplc含量2.3.1预柱和检波柱PhenomenexLuna5μmC18(2)(250mm×4.6mm);预柱:SecurityGuardCartridgesC18(3.0mm×4.0mm);流动相为四氢呋喃-水(38∶62);流速1ml/min;柱温40℃;检测波长254nm;进样量20μl。对照品与样品色谱图见图2。2.3.2对照品贮备液的制备精密称取五味子酯甲对照品5.8mg,置5m1量瓶中,用少量甲醇加热溶解,冷却至室温后加甲醇制成每毫升含1.16mg的溶液,作为对照品贮备液。2.3.3超声减失法取南五味子样品粉末(过三号筛)约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密吸取续滤液25ml,浓缩并定容至10ml,离心,即得。2.3.4进样的测定精密吸取五味子酯甲对照品贮备液适量,加甲醇制成含五味子酯甲11.4,28.5,57,85.5,142.5,285,570μg/ml的溶液,分别吸取20μl进样测定。以进样质量为横坐标,峰面积为纵坐标进行回归,得回归方程:A=22.71C+10.65,r=0.9999,结果表明五味子酯甲在0.228～11.4μg与峰面积呈良好的线性关系。2.3.5检测限的确定采用信噪比法,将对照品溶液逐步稀释至约3、10倍噪音的浓度,结果表明,检测限为2.03μg/ml;定量限为6.96μg/ml,RSD值为1.35%。2.3.6样品的加样回收取同一份对照品溶液,按上述色谱条件连续进样6次,以峰面积积分值平均值计算,五味子酯甲的RSD值为2.57%;取9号样品粉末制备供试品溶液,按上述色谱条件连续进样6次,以峰面积积分值平均值计算,五味子酯甲的RSD值为2.58%。结果表明方法精密度良好。2.3.7样品稳定性试验取9号南五味子样品粉末0.5g,按“2.3.3”项下方法,制备供试品溶液,分别于1,2,3,4,5d进样,计算五味子酯甲含量,其RSD值为2.79%,表明样品在5d内稳定性良好。2.3.8hplc分析取9号药材样品粉末0.5g,精密称定,按“2.3.3”项下方法,分别制备6份供试品溶液,进行HPLC分析,测定五味子酯甲的平均含量为0.42%,RSD值为3.50%。结果表明方法重复性良好。2.3.9加样回收和加样回收率取6个具塞锥形瓶,分别精密加入浓度为0.96mg/ml的对照品溶液1ml,于水浴上蒸干后,取9号样品6份,每份约0.25g,精密称定,按“2.3.3”项下方法,制备供试品溶液,测定五味子酯甲的含量,并计算加样回收率,平均加样回收率为100.7%,RSD值为2.20%。2.3.1味子酯甲含量的测定取各批次南五味子样品,每批3份,按“2.3.3”项下方法,制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定五味子酯甲的含量,并按干燥品计算样品的五味子酯甲含量。结果见表2。根据10批药材的测定结果,建议南五味子干燥品含五味子酯甲不低于0.20%。2.4酯甲含量测定结果采用“2.3.3”项下相同的条件测定了10批醋南五味子样品中五味子酯甲的含量,样品色谱图(见图2),平均加样回收率为103.0%,RSD值为1.07%,样品含量测定结果见表2。根据10批饮片的测定结果,建议醋南五味子干燥品含五味子酯甲不低于0.20%。3南药质量评价五味子S.chinensis(Turcz.)Baill.和华中五味子S.sphenantheraRehd.etWils.的果实传统上均作为药材五味子使用,临床应用并无区分。但研究表明,两者在化学成分上有明显差异,说明两者的质量和疗效应有不同。因此,《中国药典》2000年版起将S.chinensis和S.Sphenanthera的果实分别以“五味子”和“南五味子”收载,并分别以主要活性成分五味子醇甲和五味子酯甲作为定量指标,但两者薄层色谱鉴别方法仍完全相同,不能有效鉴别。本文采用南五味子区别于五味子的特征性成分安五脂素为对照品、经磷钼酸试液加热显色进行南五味子的TLC鉴别,特征明显、专属性强,可作为南五味子药材及醋南五味子的定性鉴别方法。水分测定结果表明,