神经粘附分子与脑发育调控机制的研究进展

神经粘附分子与脑发育调控机制的研究进展

mcclovac细胞胶原子（rcam）是mccl原子的免疫球蛋白超家族。它显示于许多动物、无脊椎动物中枢神经系统和周围神经系统细胞表面的糖蛋白。在正常肝细胞的微带生长、神经纤维成束、触觉可塑性、学习和记忆中发挥着重要作用。近来人们发现内源性及外源性硫酸化氨基聚糖均可影响到NCAM的功能,现将NCAM结构与功能研究进展及硫酸化氨基聚糖对其功能影响作一综述。一、igam结构域与ncam亲相似性结合NCAM于1976年由Rutishanser等首先在鸡的视网膜及脑中发现。在成人脑内,主要有三种形式:NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120。这三种形式的NCAM均含相同的胞外区,包括N端的五个Ig同源结构域(IgⅠ、IgⅡ、IgⅢ、IgⅣ及IgⅤ)和两个纤连蛋白Ⅲ(fibronectinⅢ,FnⅢ)结构域,两个相邻结构域由二硫键相连。与FnⅢ结构域连接的IgV结构域上有多聚唾液酸(polysialicacid,PSA)—α2,8-连接的线性同源多聚唾液酸的主要结合位点,其中第459位和第430位的天冬酰胺是其糖链的糖基化位点;IgⅣ结构域在NCAMmRNA转录体中存在选择性拼接可变结构域的外显子(variabledomainalternativelysplicedexon,VASE)时,可插入10个氨基酸的额外序列;IgⅢ结构域与NCAM亲同性结合有关,但近来的研究显示此结构域并非唯一有关区域;IgⅡ结构域则可亲异性结合肝素样多糖。这三种NCAM的主要区别在于胞内区的大小及与膜的整合方式的不同。NCAM-180和NCAM-140属跨膜糖蛋白,包含一跨膜区和胞质区,但NCAM-180的胞质区比NCAM-140的含氨基酸残基多;NCAM-120无胞质区及跨膜区,通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)直接与膜相连。多唾液酸化NCAM(PSA-NCAM)主要存在于胚胎期及早期新生动物脑内,成年脑内具高水平结构重塑的局部区域,包括嗅觉系统和海马组织的苔藓纤维系统,也有其存在。近来,有人从人胚胎脑的cDNA文库中克隆了一种跨膜NCAM样分子一NCAM2,其编码基因位于人21号染色体上,功能不详。NCAM不仅在神经系统中表达,而且在肌肉、上皮等非神经组织中亦有表达。NCAM由同一基因编码。在NCAM基因序列中,有多个部位是转录终止区,对不同区域的表达则形成不同的NCAM。当表达终止于外显子13时形成可溶性NCAM,外显子15表达时形成以GPI整合入膜的NCAM,外显子16～19表达时则形成跨膜的NCAM。NCAM结构的多样性除源于不同拼接方式外,还有糖基化、磷酸化、硫酸化等翻译后修饰的差异。对NCAM糖基化研究较多的是多唾液酸化,此过程是由聚涎酸基转移酶(polysialyltransferase-1,PST)和/或涎酸基转移酶X(STX)催化完成的。二、非典型和作用机制(一)csamsarcam亲同化结合激活NCAM在神经系统发育过程中可调节神经细胞轴突生长、迁移及目标识别。这些作用是通过NCAM亲同性结合及亲异性结合实现的。NCAM介导同源细胞粘附,其机制还未完全阐明,目前研究显示可能有三种:(1)相邻细胞上的两个NCAM分子可通过各自的IgⅢ结构域的相互作用实现NCAM的亲同性结合;(2)通过两个NCAM分子的5个免疫球蛋白结构域反平行结合来实现;(3)两个NCAM分子上的IgⅠ和IgⅡ结构域-IgⅠ1和IgⅡ2、IgⅡ1和IgⅠ2-的交互结合。NCAM的亲同性粘附受NCAM的糖基化或/和NCAM的选择性拼接的影响。NCAM上有PSA存在时,由于PSA是一线性α2,8-唾液酸的多聚物,可形成带有大量负电荷的水化球,在IgⅤ结构域附近产生较大的空间位阻,可使细胞-细胞间的粘附作用降低,故PSA-NCAM是一种具较弱粘附性的NCAM形式,这有利于脑发育及成年脑组织突触塑型时结构的重组。这种亲同性结合可激活细胞内的信号转导途经,可能与成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)受体有关。FGF受体上含细胞粘附分子的同源结构域(celladhesionmolecularhomologydomain,CHD)。CHD上有3个相邻的序列,分别与NCAM、细胞粘附分子L1及N-cadherin同源。NCAM可能通过与CHD上的NCAM同源结构域结合来调节FGF受体活性。而FGF受体又激活磷脂酶Cγ(phospholipaseCγ,PLCγ)产生甘油二酯(diacylglycerol,DAG),通过电压依赖性钙通道诱导Ca2+内流。通过激活这一途径,NCAM亲同性结合可促进原代培养的神经元和神经元细胞系的轴突生长。但NCAM亲同性结合激活的细胞内信号转导途经可能要比上述复杂得多。有资料显示,NCAM刺激轴突生长作用尚需p59fyn酪氨酸激酶参与。即NCAM刺激轴突生长可能有两种途经:NCAM-Ras-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径和NCAM-FGF受体-PLCγ-蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)途径,且这两种途径可能均是必需的。在NCAM中,PSA是影响NCAM作用的关键因素之一。NCAM缺乏的小鼠嗅球明显变小,这是由于缺少PSA使嗅颗粒细胞前体细胞迁移减少所致。PSA为齿状回颗粒细胞苔藓纤维生长所必需,缺乏PSA-NCAM的小鼠苔藓纤维不成束,可影响海马CA3区突触的产生。De-Stefano等认为PSA-NCAM不仅参与了发育过程中的突触重建,而且在损伤诱导神经元可塑性方面也起着重要作用。(二)体外受精时间及影响海马突触前后膜上存在大量的NCAM,在持续性突触发生和可塑性脑区均有与轴突在发育阶段生长类似的特征性NCAM的表达,其作用发挥与其分子结构有关。在胚胎发育早期,含VASE的NCAM转录体低于3%,而在成年中枢神经系统中,这种NCAM转录体可达50%,此时NCAM对轴突生长的刺激作用大大降低;相反,PSA在胚胎发育早期NCAM中含量丰富,可达30%,此时NCAM对轴突生长刺激作用强,而成年后PSA含量减少,仅为10%,对轴突生长刺激作用变弱。随着胚胎的发育成熟,含VASE的NCAM转录体的量逐渐增多而NCAM分子中PSA的含量逐渐减少,使NCAM刺激轴突生长作用逐渐减弱,对神经系统可塑性影响也由提高转为抑制。即PSA下调伴随着NCAM由促可塑性分子向促稳定性分子的转化。在体外孵育的海马脑片中加入NCAM抗体后可抑制海马CA1区长时程增强(longtermpotentiation,LTP)的产生,这种作用在高频刺激后几秒钟内明显显示出来,提示NCAM可能影响LTP的诱导或早期维持,且依赖PSA的存在,因为酶去除PSA后LTP诱导受到抑制。(三)hspg及可溶性硫酸软骨素蛋白聚糖有资料显示突触前后连接是NCAM介导的,NCAM-140在突触前后膜上均有表达,而NCAM-180仅限于后膜上。Rose等发现在雏鸡一次性被动回避行为模型的长时记忆形成过程中,有两次蛋白质合成高峰期。阻断该两时段糖蛋白的合成均可导致小鸡对回避行为的遗忘。进一步研究发现,NCAM合成增加出现在糖蛋白合成的第二峰,故推测糖蛋白合成的第一峰可能反映已存在蛋白质的转录后修饰,第二峰可能反映新蛋白质的合成。成年大鼠在学习训练后其海马齿状回颗粒细胞中NCAM多唾液酸化程度升高,主要发生在NCAM-180上。这是否与突触形成的选择性稳定化作用相一致,尚需进一步探讨。三、硫酸化氨基聚糖对NCAM及记忆的影响目前发现存在于神经系统中的几种蛋白聚糖(proteoglycans,PGs)。(1)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfatePG,HSPG)类:①GPI家族,如糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)、脑蛋白聚糖(cerebroglycan),②粘结蛋白聚糖(syndecan)家族,如神经粘结蛋白聚糖(N-syndecan),③细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)家族,如串珠样蛋白聚糖(perlecan)、存在于神经-肌肉连接点突触部位的乙酰胆碱受体集聚因子(agrin);(2)硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitinsulfatePG,CSPG)类:①可聚蛋白聚糖(aggrecan)家族,如aggrecan、短小蛋白聚糖(brevican)、多能蛋白聚糖(versican)、神经蛋白聚糖(neurocan),②其他,如双链蛋白聚糖(biglycan)等。这些物质广泛分布于发育的及成熟的神经系统细胞表面及细胞外基质上,可调节发育中的细胞分化、轴突生长及中枢神经系统中神经元的再生,使得蛋白聚糖可参与与学习和记忆相关的神经结构与功能调节。CSPG分子上的寡糖富含硫酰基和磺基,具强抗原性,是CSPG分子的表面抗原决定簇,如HNK-1抗原。Hottman从细胞趋化素中分离出一种具有HNK-1抗原决定簇的CSPG,它参与神经细胞与神经胶质细胞之间的粘附,与神经嵴的定位有关。在鸡视网膜发育中CSPG和HSPG的含量发生着变化,CSPG相对增加的同时HSPG相对减少;在新生鼠发育中也有类似情况发生。早期鸡脑发育可能更多依赖于HSPG介导的功能,更复杂的脑结构如中脑盖的发育则需要HSPG介导功能的下降和/或CSPG介导功能的增强。PGs可正性或负性调控轴突和树突的伸展,HSPG的表达与轴突产生及生长有关,而CSPG则一般被认为可抑制轴突生长。用含β-木糖苷(外源性的β-木糖苷能完全抑制PC12细胞内CSPG合成,对HSPG的合成也有抑制作用)的培养液孵育PC12细胞,则该细胞分裂停止,轴突生长加快。agrin与NCAM都位于神经肌肉连接的突触位点上,两者之间的相互作用极可能是轴突产生中的关键。从星形胶质细胞条件培养基中纯化的HSPG和可溶性硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)能诱导大鼠皮质神经元和运动神经元的轴突延长。鸡脑中轴突生长活跃的轴突干和基板上有HSPG存在,酶去除HS可干扰轴突生长。可溶性HS能影响非洲蟾蜍胚胎视网膜覆膜层的延展,提示HSPG促轴突生长作用与连接于核心蛋白上的HS链有关。HSPG促轴突生长作用可能部分是通过与NCAM作用介导的,Cole等发现在视网膜细胞粘附过程中有NCAM上的肝素结合结构域(heparinbindingdomain,HBD)和细胞表面HS的参与。参与结合的NCAM上的HBD的氨基酸序列为:131IWKHKGRDVILKKDVRFI148,但参与结合的HS链的特异性糖序列还未知。CSPG也可与NCAM发生直接作用。phosphacan是一种由星形胶质细胞合成的可溶的神经组织特异CSPG,含受体型蛋白酪氨酸磷酸酶的整个胞外区,即RPTPζ/β。phosphacan可与NCAM可逆结合,具高亲和性(其与NCAM的Kd为0.1nmol/L),为神经元和胶质细胞粘附和轴突增生的强抑制剂。Milev等发现phosphacan/RPTPζ/β与NCAM的作用是由天冬酰胺(Asn-232,Asn-281)连接的寡糖介导的。肝素样聚糖在活性依赖的突触可塑性中起关键作用。Lauri等发现HS完整在LTP早期表达中是必需的,而参与此过程的HSPG可能为N-syndecan,其分子中具有高比例的2-0-和6-0-硫酸化单糖残基的HS存在。选择性2-0-和6-0-去硫酸化可破坏聚糖抑制LTP的作用,提示N-syndecan中的肝素样聚糖及其硫酸化修饰在其生物活性中起重要作用。N-syndecan可与多种生物大分子如NCAM、FGF、肝素结合的生长相关分子(heparin-bindinggrowth-associatedmolecule,HB-GAM)等结合,并作为胞外肝素结合分子与fyn转导途径的中间传递体调节着活性依赖的神经元的连接。近来有资料表明,肝素对学习和记忆也有影响。腹腔内给予Wistar大鼠肝素5天,发现可提高动物获取食物能力及空间学习能力。早期研究发现,肝素可在体外与NCAM结合,NCAM结合肝素具时间依赖性、饱和性,Scatchard和Hillplot分析显示两