中枢神经系统神经元轴突再生的研究进展

中枢神经系统神经元轴突再生的研究进展

传统观点认为，在中枢神经系统损伤后，无法修复或再生。1981年，根据agaso等人的研究，损伤后的cns轴突可以在适当的环境下再生。然后，在cns损伤后，回归的概念被提出，并在随后的研究中得到证实。目前研究的成果认为:脊髓损伤后限制神经轴突生长或再生的因素可分为两类:一是神经营养因子和支持引导神经生长的基质成分缺乏;二是脊髓断端产生的囊腔和瘢痕组织以及一些抑制性生长因子等抑制轴突生长。因此,创造损伤修复的最佳微环境是解决此问题的首选方法。本文就目前脊髓损伤微环境方面的研究现状做一综述。1轴突生长促进因素1.1ntf基因修饰细胞移植治疗髓伤1952年Levi-Mnotacini首次发现并证实了NGF对再生的轴突有刺激生长作用后,对神经营养的研究成为一个活跃的研究领域。目前已知的NTF有20余种。大量研究证实,在损伤后的神经系统,NTF可以促进神经元存活和轴突再生。Bregman等在脊髓横断处植入含有BDNF或NT-3的明胶海绵后发现BDNF和NT-3能明显抑制脊髓损伤引起的红核神经元萎缩。Blesch分别把BDNF和NT-4/5基因修饰的细胞导入脊髓损伤处,结果显示表达的BDNF和NT-4/5主要促进脊髓下行神经纤维再生及运动功能的恢复。采用NTF基因修饰细胞移植治疗脊髓损伤已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。过去10年中,围绕基因治疗,虽然在许多遗传性基因缺陷疾病或癌症治疗上有了显著进步,但在脊髓损伤方面仍是相当前沿的科学。1.2补偿后的创造GAP-43是神经组织特异性磷酸蛋白,主要分布于神经元、再生的施旺细胞和神经胶质细胞,被认为是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物。GAP-43可促进神经元的生长发育及突触的重构,在神经损伤后修复时,轴突内GAP-43的含量可增加20~100倍。GAP-43高表达被认为是神经生长修复的典型特征。GAP-43表达的调控机制尚不清楚,推测GAP-43表达与转录后的调节密切相关。Schmidt-Kastner等研究损伤后GAP-43不是无限量无限期的增加,它在损伤的早期即刺激强度较大时增加明显,随着损伤修复过程的发展,GAP-43的量不断减少,一旦代偿的突触联系重新建立,GAP-43的量也降到了原来的基础水平。单靠CNS损伤后自身有限的可塑能力和损伤刺激产生的有限的GAP-43促进神经再生常常不足以完全代替神经损伤,所以一些无法修复代偿的损伤造成了后遗症,那么在临床上如果能采用一些干预手段促进GAP-43表达量增加和表达时间延长,使得CNS的反应性再生、结构重建能充分修复损伤,这对于CNS损伤的急性期处理、后期康复治疗都具有十分重要的意义。1.3与肌动蛋白的配合性生物酶抑制剂Homer蛋白是一种有多个结构域的胞质蛋白,作为支架蛋白,能通过调节蛋白质之间的相互结合而发挥广泛作用,包括影响发育中的神经元对外界信号作出反应,促进神经元轴突的发芽和延伸。Shiraishi等认为发育小鼠小脑颗粒细胞中表达分泌的Cupidin是一种Homer蛋白家族成员,可激活Rho家族中的GTPase,并与肌动蛋白结合,从而使细胞骨架的有序性发生改变,重新排列,以对周围环境中或吸引或排斥的因素作出适应性反应。Foa连续摄影观察了视觉顶盖细胞的轴突投射、致靶,并比较了不同长度及不同突变点的Homer蛋白对这一过程的影响,提出三种Homer发挥效能的可能机制:①干扰Ca2+的释放聚集将阻碍突起延伸并改变生长锥对指导信号的反应;②影响生长锥表面的受体分布,阻断Homer,妨碍生长锥对周围信号分子的正确识别;③直接调控肌动蛋白的组装。Homer究竟以何种方式发挥作用还有待深入研究,但可以肯定的是,正确适宜地发挥调节轴突识靶、寻路的作用,需要轴突生长锥中有适宜浓度的Homer,浓度不能太高,也不能太低,并且Homer在时间空间上的分布也要合适。2轴突生长的抑制因素2.1nogo-a和ng-a在细胞内表达治疗Nogo蛋白属Reticulon家族成员,已经鉴定出3个Nogo的cDNA序列分别编码三种不同的Nogo异构体,即Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C。CNS神经元损伤后,溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,与其特异性受体复合物结合,通过第二信使作用于Rho,对生长锥中的微丝进行调节,使生长锥溃变,抑制轴突再生。除上述机制外,Nogo-A还对轴突生长相关基因有下调作用。此抑制作用的细胞内信号转导机制目前尚不清楚。现在,与Nogo相关的基因和药物治疗将成为CNS损伤后促进轴突再生及抗肿瘤的新的有效手段。目前已有人在构建抗NgR的基因工程单克隆抗体,以阻断Nogo-66、MAG、OMgp三种因素对轴突再生的抑制,其有效性有待进一步实验证实。NgR的竞争性拮抗剂-NEP1-40已被成功制备出来,相信在不久的将来,研制出更为全面有效的阻断剂和转神经营养因子基因的干细胞一样,将是促进神经再生的又一热点。美国加州大学Goldbery和Barree博士对此给予很高的评价,认为Nogo基因的发现是探索脊髓损伤和中风病人治疗漫长道路中的一个里程碑。2.2g调控轴突生长MAG是髓鞘的重要组成成分,其参与髓磷脂结间部的形成,通过影响神经纤维的磷酸化过程而抑制轴突发芽,使神经纤维数量稳定在一定水平上。同时,MAG亦调控着轴突生长锥的行为,通过引发生长锥的崩溃而抑制轴突的生长。MAG是导致CNS和PNS神经再生能力差异的重要原因之一。MAG约占中枢髓磷脂蛋白的1%,占外周髓磷脂蛋白的0.1%,PNS髓磷脂中MAG含量只有CNS的1/10,因此PNS髓磷脂对神经再生抑制作用较弱。另外,PNS损伤后,吞噬细胞迅速聚集在损伤部位,髓磷脂碎片清除较快,利于轴突再生。相反,CNS损伤部位吞噬细胞较少,抑制性物质不易清除,轴突再生受到抑制。2.3cspg的调节作用研究表明CSPG主要分布于神经元周围的基质中,通过置换结合在含多聚赖氨酸底物中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可抑制轴突生长。每个神经元周围的基质中CSPG含量不同,提示CSPG参与调节神经元微环境的关键因素。聚集蛋白聚糖家族(aggrecanfamily)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、神经蛋白聚糖C(neuroglyC)是哺乳动物CNS发育中的3种经典的CSPG。在生理条件下,CSPG的作用可能主要表现为抑制轴突的无序生长和防止神经纤维的异常连接。多数学者认为星形细胞形成的胶质疤痕是中枢抑制因子的重要来源,而CSPG在胶质疤痕中表达上调。Asher的研究中还发现TGFβ和EGF/TGFa可以增加CSPG的表达,而PDGF和IFNγ可减少其表达。也许通过控制这些物质的数量能调节CSPG的表达,从而影响轴突的生长。因此认为,CSPG的抑制作用或许在神经发育过程中保证轴突沿正确方向延伸,消除错误分支时发挥过重要功能。这一点也引起了对CSPG在发育中的作用机制的特别关注。最近的研究发现,CSPG对轴突生长的抑制作用由Rho/ROCK通路介导,这为干预CSPG的作用以促进中枢神经的修复提供了新的思路。3暗号at投资/orrepunsing神经系统发育过程中,神经元轴突到达远距离的靶细胞形成连接是最为关键和精细的环节。这种正确的导向主要依赖于周围环境中的吸引和/或排斥暗号(attractiveand/orrepulsiveguidancecue)。导向暗号主要有netrins、slits、semaphorins和ephrins。导向暗号与相应的膜受体结合,通过Ca2+、cAMP、RhoGTP酶信号通路,活化细胞骨架合成相关蛋白profilin、ENA/WASP和Arp2/3分别调节actin的聚合和逆流,最终引起细胞骨架向正确的方向延伸。3.1工商网络中有效激活线性小g蛋白,激活回复突变的第三人影响细胞的活性导素(Netrins)是一种分泌蛋白,在神经发育所需的轴突导向及细胞迁移中发挥双重导向功能——吸引或排斥,其主要依赖于生长锥所表达的不同受体结肠癌缺失蛋白(DCC)或UNC5同源物(UNC5H),从而传递不同信息。目前发现在几乎全部物种中,Netrin蛋白在神经系统高表达,缺乏Netrin导致本应向中线生长的神经轴突方向发生错误。Netrin-1是家族中研究最多的分子。Tessier-Lavigne报道生长锥的环核苷酸水平影响其对轴突导向因子的反应性,cAMP/cGMP比例增高激活Netrin-1对轴突产生吸引作用;比例降低则产生排斥作用,这主要是通过调节细胞膜上Ca2+通道开放,改变Ca2+水平而实现的。最近还发现Netrin-1与DCC结合可激活小G蛋白(GTPs)如Rac-1和cdc42,而Rac-1和cdc42则广泛参与细胞骨架形成并影响细胞活动。另外,由于生长锥富含细胞骨架蛋白,有学者认为轴突导向因子是通过诱发骨架蛋白重建而发挥功能。3.2plusin-b的晶体结构及亲水性能信号素(Semaphorins)是一类分泌型跨膜蛋白,可引起轴突的排斥反应。近年来许多实验表明,胶质瘢痕对Semaphorin的表达分泌关系密切。在神经发育期Semaphorin抑制/排斥轴突生长锥,影响生长锥伸展方向,确保其向靶组织定向生长。Vikis等提出:Neuropilin并不单独发挥作用,只是Plexin-B的辅助受体。而Plexin-B却可以单独或协同Neuropilin起作用,与活化的Rac相互结合,此过程中Plexin-B的胞内结构域CRIB(Cdc42/Rac结合部位)不可或缺。进一步研究发现:Plexin-A3和Plexin-C1没有此作用,RhoA和Cdc42也不能结合Plexin-B1,说明Plexin-B1和活化的Rac的结合是非常特异的。另外,瘢痕周边的成纤维细胞分泌的SemaⅢ是否对瘢痕内新生血管的形成以及瘢痕抑制轴突损伤后再生产生影响,与何种受体结合、通过何种信号转导途径都是值得进一步探讨的问题。3.3slit蛋白和robo基因Slit是由胶质细胞分泌的细胞外基质蛋白,1984年在果蝇胚体首次鉴定出参与决定其幼体角皮颜色的Slit基因,至1999年,发现Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受体,从此对Slit功能的认识才有了突破性的进展。迄今为止,从果蝇至哺乳类动物,已发现了三种Slit和三种Robo基因及其表达产物,并对它们在神经系统发育、损伤和再生中的作用有了初步认识。体外实验证明,Slit蛋白具有双重功能,能排斥运动神经元轴突和促进感觉神经纤维的分支和延伸,其排斥和吸引的性质不仅取决于Slit本身和受体Robo,而且与轴突内第二信使的浓度有关。最新的研究表明,slit不仅可排斥轴突的伸展方向,还可逆转神经元的迁移方向。3.4eph家族蛋白Eph/Ephrin是目前已知的具有最多成员的蛋白受体酪氨酸激酶家族,该亚族的大多数成员主要在神经系统以独特的重叠模式表达。越来越多的研究表明,Ephrin/Eph不仅调控局部神经元的投射、换元、突触重塑、功能建立及干细胞的增殖分化迁移都有密切的关系,而且还可以指导生长轴突的寻靶。Drescher和Vanderhaeghen等研究发现Eph受体调节神经纤维投射和精确的解剖定位,若破坏Ephrin-A5基因,在新皮层躯体感觉区域产生混乱的并且投射到前脑感觉纤维缺乏。Eph家族蛋白还影响神经元初始接触突触和突触维持的发育过程。它们激活突触双向信号通路,破坏突触的稳定性而激发突触的可塑性;通过EphB2与Ephrin-B1相互作用可产生粘附作用,EphB2和Ephrin-B1在突触的定位很有可能依靠PDZ结合域。Eph/Ephrin参与损伤后的神经再生过程。脊髓外伤后EphB3表达增高,阻滞EphB3后再生增强;EphrinA也抑制轴突生长并影响细胞生存,表明Eph/Ephrin可能是损伤后再生的不利因素。4成立监控细胞的毒中枢胶质细胞不能象外周神经施旺细胞为轴突再生提供理想的条件及化学因子,相反,中枢胶质细胞能产生多种毒素,杀死神经细胞和受损的神经轴突。同时,胶质细胞增生,堆积于损伤处,形成紧密的疤痕结构,阻断轴突