nogo蛋白与中枢神经损伤修复机制

nogo蛋白与中枢神经损伤修复机制

中枢神经系统（cns）轴突再生的主要障碍之一是缺乏抑制再生的蛋白质。Nogo是目前已发现的三种重要的轴突再生抑制蛋白之一,另外两种即髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associatedglucoprotein,MAG)和少突胶质髓磷脂糖蛋白。有关研究表明,上述各种物质均通过一种糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol,GPI)受体——Nogo受体(NgR)起作用,进而提出了通过阻断NgR来促进神经元轴突再生的设想。1nogo蛋白的结构和生物学功能1.1nogo-a在n、n组织及安全性中的转录表达有关Nogo蛋白的研究大多是2000年以后进行的。Chen和PrInjha以及Grandpre的课题组在2000年成功地克隆了Nogo基因,其中Chen和PrInjha是用相关序列探针方法从大鼠cDNA文库中克隆得到,而Grandpre等的研究工作都是在Schwab等研究相对分子质量为250kD的轴突生长抑制性蛋白NI-250(即Nogo-A)同源物肽段序列的基础上进行的。Nogo分子有A、B和C三个不同的异构体,它们是同一Nogo基因(在人类位于染色体2p13-14)通过不同的启动子或RNA剪接方式形成的。Nogo-A、B和C在N端没有典型的分泌信号肽序列,在C端有一共同的氨基酸序列,其中有两个长的疏水序列形成跨膜区,这一区域与主要定位于内质网的浆膜蛋白家族有很高的同源性。大多数Nogo分子分布于内质网膜,少数分布于细胞表面。在CNS,Nogo主要分布于白质中,在髓鞘和培养的少突胶质中均可以检测到,而Nogo-A主要存在于CNS髓磷脂和少突胶质中。大鼠的Nogo-A转录体编码1163个氨基酸。Nogo-A的活性部位可能有两个:位于两个疏水区域之间的Nogo-66和N末端到第一个疏水结构域这部分肽链,即N-Nogo。Nogo-A主要表达于CNS,位于投射神经元和形成髓鞘的少突胶质中,在胞膜、胞质和胞核中都存在。曾有学者采用原位杂交方法发现了Nogo-A在人或大鼠体内的分布规律。第三军医大学叶剑等报道,大鼠的大脑皮质、基底神经节、丘脑、下丘脑、延髓、脑桥、小脑、中脑、脊髓前后角及视神经中均有Nogo-AmRNA分布,且主要位于胞浆;在脑、脊髓组织中呈散在分布,脊髓腹侧2/3部分有强烈表达,在背根神经节、自主神经节中也有较强活性,而坐骨神经中则无Nogo-A表达。Huber等研究发现,Nogo-A在鼠胚神经组织中、海马、皮质的梨状细胞层、红核和动眼神经核中有明显的表达,除CNS之外,在其他组织系统如肌肉、睾丸和心脏也发现有表达。Nogo-B与Nogo-A相比,缺少了186~1004残基,相当于大鼠的相对分子质量为35kD(NI-35)的蛋白。而Nogo-C在相同位置缺少了相同数目的残基,但N端更短,故分子质量最小,相当于以往描述的大鼠的VP20和foocen-s。1.2nogo-a和ngr在轴突生长过程中的作用Nogo-A是在CNS外伤后具有轴突再生抑制作用的因子,被称为髓鞘相关蛋白。它可以使生长锥溃变并抑制轴突生长,针对Nogo-A的抗体在体外可以中和CNS髓鞘的大部分抑制活性。许多研究表明,Nogo-A和NgR在轴突生长的过程中就有表达;细胞核上免疫金标记的Nogo-A主要存在于染色体的核小体上,表明其可能与基因转录有关;Nogo-A的表达与一些髓鞘形成有关的因子如α-微管蛋白、髓鞘基础蛋白的表达有密切联系,这也暗示Nogo-A可能与髓鞘形成有关。通过进一步的研究阐明Nogo-A的功能是有必要的。而Nogo-B的N末端可以促进内皮细胞的生长而抑制血管平滑肌的生长,因此可以调节血管内环境稳定及血管重建。Nogo-C在体外也能导致背根神经节神经元生长锥溃变,但由于二者分布较广,其作用靶点可能不仅限于CNS中。2ngr的结构和生物学功能2.1x线晶体衍射目前,有关NgR的结构研究已经取得了一致的意见。即NgR属GPI锚定蛋白,具有多个富含亮氨酸的重复结构。NgR由473个氨基酸残基组成,从N端至C端包含1个信号肽、亮氨酸重复序列型N端(LRRNT)、8个亮氨酸重复序列(LRR)、富含半胱氨酸型C端延伸区(LRRCT)、特异性C末端以及1个GPI结构。X线晶体衍射提示NgR分子形似弯曲的香蕉,有一个凹面与一个凸面,长宽高大约为0.80nm×0.35nm×0.35nm,含有少量的二级结构。分子凹面为平行的β片层,凸面为一些连接β片层的环状结构。LRR结构域占据了NgR分子的大部分空间,每一个亮氨酸重复序列由一个凹面的β片层与延伸至凸面的环状结构构成。NgR的GPI结构域与其他分子中的LRR结构域有一定的同源性。使用特异性磷脂酰肌醇磷脂酶C可以将NgR分子从胞膜上解离,说明NgR分子通过GPI结构固定于细胞膜表面。而GPI锚着结构的存在提示胞膜上可能还存在着其他受体亚单位,与NgR协同作用,向胞浆内传导Nogo-66细胞生长抑制信号。2.2神经末梢生长和营养因子的作用NgR的作用主要是保持皮质海马等区域神经元回路的稳定性以及允许这些区域在结构上有一定的可塑性。某些部位的NgR蛋白在CNS有突触联络作用,暂时性的NgR下调将允许活性差的神经纤维在有关营养因子的作用下再造,而且NgR和细胞黏附因子下调在多种神经营养因子的共同作用下允许神经末梢生长,NgR还可能有调节活性依赖的突触再造和长时程记忆的作用。3nogo蛋白质与ngr以及中枢神经再生之间的关系3.1nogo-a抑制剂目前一致认为,Nogo-A是CNS髓磷脂神经元轴突生长抑制因子。研究表明,神经元在生长过程中对Nogo基因的表达变化特别敏感,因此,Nogo在具有高度可塑性的脑区域(比如海马)的神经元回路塑型过程中发挥重要作用。最近研究表明,Nogo蛋白、MAG通过Rho的激活抑制神经元生长,而Rho的激活又是由于神经营养因子受体p75NTR和NgR复合物的作用。Nogo-A抑制背根神经节神经元轴突生长及肺成纤维细胞(3T3)延伸生长,呈剂量依赖性,并能被单克隆抗体IN-1(Nogo-A抗体)和ASBruna所阻断。IN-1可中和Nogo-A蛋白,拮抗Nogo-A对轴突生长的抑制作用,促进损伤后神经元轴突再生。Nogo-A的N端及Nogo66均有很强的轴突生长抑制作用。国外的研究发现,给予IN-1抗体可使成年大鼠受损脊髓的运动功能得到部分恢复。Nogo-A可能通过以下几种方式抑制神经元轴突再生:完整少突胶质表面的Nogo-66直接与损伤神经元的NgR结合,简称细胞-细胞方式;从受损少突胶质脱落下来的含Nogo-66的膜片段与损伤神经元的NgR结合,称为细胞-膜方式;还有一种是完全溶解的少突胶质释放Nogo-A的N端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,与其受体结合,其抑制作用更强。另外,Nogo-A还通过下调轴突生长相关基因发挥抑制神经生长的作用,因为轴突再生需要受损神经元上调某些与生长相关的基因,如c-jun、jun-D、gap-43等。当神经元去除了某些来自轴突的抑制信号(如Nogo-A等)时,上述基因的表达上调,从而轴突得以再生。其依据是使用IN-1后,细胞生长相关基因表达上调,轴突再生明显。此抑制作用的细胞内信号传导机制目前尚不清楚。Nogo-B、Nogo-C是否存在抑制作用还有争议。3.2抗fd-pcr作用Nogo-A和NgR之间可通过多个位点交互作用,从而使NgR被Nogo-A激活。最常见的活性位点是Nogo-66和N-Nogo-A。在两个Nogo疏水区域之间存在的一个短的亲水Nogo-66环与一个Nogo-66受体(NgR)结合在一起,从而抑制轴突生长。轴突生长和神经纤维的延伸还被N-Nogo-A区域抑制,它可以被不同的受体复合物机制介导。这两种NgR结合Nogo-A区域的汇合产生配体,实质上加强了NgR的亲和力,并将NgR由一种抑制蛋白转换为发挥促进作用。含有NgR的神经元在上述几种物质存在时,其生长核心均遭受破坏,而无NgR的神经元则不受影响。这些不受影响的神经元在转染了NgR后又变得对上述物质异常敏感。相反,使用抗NgR作用之后,它对神经元再生的抑制作用则大大减轻。尽管可能还存在与NgR功能相近的受体,但阻断NgR得到的对神经元再生功能抑制的解除效应是十分明显的。因而NgR基本上被认为是一种主要有抑制作用的受体。4nogo的机制多种研究(包括两种大型基因扫描和Meta分析)证实,Nogo与早发性痴呆和精神分裂症有潜在关系。最近,Rouleau等使用原位杂交及定量逆转录PCR方法观察到,Nogo在这些患者的额叶皮质有明显的过量表达。大量事实证明,Nogo在疾病的发生中发挥重要作用,多发性硬化症的脱髓鞘损伤也与Nogo-A及NgR有关,CNS的缺血及外伤后神经元生长被抑制均与Nogo的轴突抑制作用有关。然而目前对Nogo的研究仍处于基础研究阶段,其临床应用的报道还很少(或成果还未真正应用于临床上对疾病的诊断与治疗)。而缺氧缺血性脑病导致的新生儿脑损伤是否与Nogo有关、给予IN-1抗体是否可以减轻脑损伤尚有待于研究。5nogo-a/b/c突变异种组尽管有关Nogo的研究已经取得众多硕果,然而当今还存在许多疑点。2003年Zheng等为研究敲除Nogo基因是否可以促进神经生长建立了两种基因敲除模型:一组为敲除Nogo-A和Nogo-B但不敲除Nogo-C(Nogo-A/B突变异种组),另一组则同时敲除这三种(Nogo-A/B/C突变异种组)。尽管Nogo-A/B突变异种组髓鞘在体外实验中降低了对神经突生长的抑制活性,但皮质脊髓纤维在脊髓半切除术后示踪没有发现神经纤维明显的再生,也没有发现这些纤维有出芽现象。这些表明仅仅敲除Nogo是不可能促使轴突广泛再生,再生还与损伤周围的环境以及周围的多种因