甘草苷的生物信息学分析

甘草苷的生物信息学分析

甘草是甘草最有效的成分之一。它是以2-氨基葡萄糖（2-phenyl-chrogogo）为母核的二羟黄酮类化合物，其化合物为p21h2o9。文献报道,甘草苷药效显著,具有抗溃疡、抗病毒、抗抑郁等作用。目前对甘草苷的神经保护及营养作用报道很少,本研究就此进行初步的考察。1材料表面1.1细胞、免疫和免疫甘草苷(中国药品生物制品检定所,批号200604,纯度>98.5%);β-淀粉样蛋白(Aβ25～35)、多聚-L-赖氨酸氢溴化物、PD98059(Sigma公司);四甲基偶氮唑盐(MTT,Fluka公司);解剖液(mmol·L-1:葡萄糖15.1,蔗糖21.9,NaCl136.9,KCl5.4,Na2HPO4·7H2O0.7,KH2PO40.2,pH7.2～7.4);阿糖胞苷(法玛西亚普强公司);神经生长因子(NGF,北京圣日公司);N2,B27(Gibco);碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,PeproTeck公司);细胞外液(mmol·L-1:NaCl150,KCl5,CaCl22,MgCl2·6H2O,Hepes10,D-葡萄糖5,pH7.4);二甲基亚砜(DMSO,晶美生物公司,Lot:RCO30711);Fluo-3AM(Biotium,Lot:F4-0723);分散剂F-127(Sigma公司,Lot:095K0016);磷酸盐缓冲溶液(PBS,博士德公司);牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司,Lot:126K0660);曲拉通X-100(TritonX-100,Sigma公司,Lot:106H0619);乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA,Amersco公司,Lot:3594B23);AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司,批号070525)。一抗:NeuronalClassIIIβ-Tubulin(Tuj1)抗体(Biotium);兔抗大鼠乙酰胆碱转移酶(ChAT)多克隆抗体(北京博奥森);兔抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体(博士德生物有限公司);兔IgG(军事医学科学院);二抗:FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金桥)。1.2净化工程的设备黑色底部不透明的96孔培养板(Corning);二氧化碳培养箱(SANYO);超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司);酶标仪(美国Thermo);微板读数仪(BMG);荧光显微镜(ZEISS);流式细胞仪(美国BectonDickinson)。1.3动物SD大鼠乳鼠,出生12h内,雌雄兼用,军事医学科学院实验动物中心提供,合格证号SCXK(京)2005-0013。2方法2.1大鼠原代海盗开元的分离、培养和鉴定2.1.1消脂金属筛网过滤参照Meller等人方法并稍加改进:大鼠乳鼠经75%乙醇消毒后,断头置于含解剖液的平皿中,分离出全脑,解剖显微镜下分离海马组织。将其置于0.25%胰蛋白酶中并用剪刀剪碎。毎隔4min吸取胰酶至含血清离心管中,直至无肉眼可见的组织块。200目金属筛网过滤后以1000r·min-1离心10min。用种植液(DMEM-F12培养液原液,10%胎牛血清,10%马血清,0.3mg·mL-1谷氨酰胺)稀释后,接种于预先包被0.1g·L-1多聚赖氨酸的培养板。次日更换培养液(DMEM-F12原液,10%马血清,1%N2,1%B27,0.3mg·mL-1谷氨酰胺,3ng·mL-1阿糖胞苷)。2.1.2tri能力的测定取培养4d的神经细胞,加95%乙醇固定15min,PBS洗涤2次后,加入含0.5%牛血清白蛋白的PBS液,10min后吸弃上清,加入含0.2%Triton-X100破膜10min后加入含有0.5%BSA,0.2%Triton-X100,Tuj1一抗(1∶250)的PBS液,于4℃湿盒内孵育过夜,另设不加一抗的对照孔,以PBS代替一抗。然后用PBS洗涤2次,加入含有0.5%BSA,0.2%Triton-X100,FITC标记的二抗(1∶200)的PBS液,于室温孵育2h,用PBS洗涤2次后加入适量PBS后于荧光显微镜下观察荧光染色情况。2.2dmem-大力推进dmso取培养7d的神经细胞,模型组换以10μmol·L-1老化处理的Aβ25～35损伤液,药物组加入0.1,1,10μmol·L-1的LQ6h后加入Aβ25～35损伤液,正常组用DMEM-F12普通培养液原液培养,3d后测MTT。方法如下:加入终浓度为0.5mg·mL-1的MTT,培养箱内继续孵育4h后吸弃上清,每孔加入150μLDMSO,振荡10min后,于酶标仪检测540nm处吸光度(A)。计算其抑制率,公式为:抑制率(%)=(A给药组-A模型组)/(A对照组-A模型组)×100%。2.3对照组的lq取培养7d的神经细胞,分别检测10μmol·L-1Aβ25～35作用48h时细胞凋亡率。药物组于Aβ25～35作用前6h加入0.1,1,10μmol·L-1的LQ,对照组加入等体积的原液。采用AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡:0.25%胰酶消化细胞,收集各孔细胞于1.5mLEP管中,3000r·min-1离心5min后用冷的PBS洗涤2次,加200μLBindingBuffer重新悬浮细胞,加入10μLAnnexinV-FITC,轻轻混匀,避光室温反应10min,加入5μLPI溶液,混匀后于室温避光孵育5min,加入300μLBindingBuffer,移入专用试管中,流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4探针负载检测ca2+浓度培养7d的神经细胞,以0.25%胰酶消化、离心后以细胞外液洗涤细胞2次。加入探针Fluo-3AM(10μmol·L-1)和分散剂F-127(0.1%),于37℃避光湿盒中负载40min。之后用含0.2%BSA的细胞外液洗涤细胞2次,以去除背景。并于荧光显微镜观察其探针负载情况。调整细胞密度为2×105个/孔接种于96孔培养板中,药物组加入0.1,1,10μmol·L-1的LQ,对照组加等体积的细胞外液。于培养箱内预孵30min后加入10μmol·L-1Aβ25～35损伤液,微板读数仪上于激发/发射波长485nm/520nm处测荧光强度。每组分别依次加入TritonX-100,EGTA,测最大及最小值,依以下公式计算Ca2+浓度。[Ca2+]i(nmol·L-1)=390×(F-Fmin)/(Fmax-F)2.5dmem/f-12培养液将分离的海马神经元重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F-12种植液,接种于预先包被多聚赖氨酸的24孔板,培养过夜后换为含3%胎牛血清,1%N2,1%B27和3ng·mL-1阿糖胞苷的DMEM/F-12培养液。药物组加入0.1,1,10μmol·L-1LQ,同时加入2ng·mL-1NGF;另设一组1μmol·L-1PD98059预孵20min后加入1μmol·L-1LQ和2ng·mL-1NGF;以2ng·mL-1NGF为对照组。2d后于荧光显微镜下拍照,并统计轴突长度。2.6甘草醇对原代海调神经干燥分化的影响2.6.1海马的叶片鉴定参照文献并稍加改进:大鼠乳鼠经75%乙醇消毒后,断头并置于含解剖液的平皿中,分离海马组织并用小剪将其剪碎,用口径递减的吸管轻轻吹打海马碎片数次,直至肉眼观察不到碎片。过200目筛后,1000r·min-1离心10min,弃上清加入含20ng·mL-1Bfgf,2%B27的DMEM/F-12干细胞培养液,吹打,置于玻璃培养瓶中,培养过夜,小心吸取上清,稍加吹打后铺于预先包被多聚赖氨酸的6孔板。2.6.2兔的igg-同基因子检测采用荧光免疫组化染色法鉴定所分离培养细胞是否为干细胞,方法同2.1.2,一抗为Nestin抗体,二抗为羊抗兔IgG-FITC标记抗体,同时设以PBS代替一抗的阴性对照组。2.6.3chat-抗和羊抗兔igg-fig-fige表达对兔igg-ssiigg-ss的激活作用干细胞培养7d后加入终浓度0.1,1,10μmol·L-1的LQ,另设一对照组。加药作用4d后,先后用ChAT-抗和羊抗兔IgG-FITC二抗标记乙酰胆碱能神经元,同时设加兔IgG-抗阴性对照组,方法同前。PBS洗涤后轻轻吹打收集全部细胞,离心后重悬于PBS中,于流式细胞仪上检测乙酰胆碱能神经元含量。2.7统计方法数据应用SPSS软件13.0统计分析,数据以ˉx±s表示,用方差分析及t检验比较组间差异的显著性。3结果3.1两种形态的生长情况最初接种的海马神经元呈圆形,2h后开始贴壁,5h内大部分贴壁,有部分细胞出现1～2个小突起。培养4d后,神经细胞突起明显增多增长并交织成网,至第7天网状更明显,神经细胞生长良好,形态典型,呈短梭形、锥形。经免疫荧光染色法染色后,于荧光显微镜下观察,对照组仅有几处非特异性荧光,加神经元标记抗体Tuj1组细胞绿色荧光明显,因此所分离细胞为神经元细胞。3.2总吸光度比对照组原代海马神经元经Aβ25-35损伤后,540nm处的吸光度比对照组明显降低(P<0.01);与模型组比,LQ组细胞吸光度增加(P<0.01)(表1)。3.3高p>0.1与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。0.1,1和10μmol·L-1LQ组与模型组相比凋亡率显著降低(P<0.01)(表2)。3.4各变量有显著差异与对照组相比,模型组细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),有显著差异。与模型组相比,0.1,1,10μmol·L-1LQ组细胞内钙离子浓度显著降低(P<0.01或P<0.05),有显著差异(表3)。3.5ngml-1ngf对2ngml-1ngf的影响甘草苷本身对原代海马神经元轴突生长无促进作用,但在2ng·mL-1NGF存在下可明显促进其轴突生长,其轴突长度明显长于对照组(P<0.01)(表4)。3.6甘草醇对原代海调神经干燥分化的影响3.6.1神经干预的评估经免疫荧光染色鉴定所培养细胞为神经干细胞,对照组仅有几处非特异性荧光,加神经干细胞标记抗体Nestin组细胞绿色荧光明显。3.6.2甘草醇促进了原代同时处理神经干燥物质的分离LQ组胆碱能神经元含量与对照组比有明显差异(P<0.01)(表5)。4甘草苷对a2535的诱导活性β淀粉样蛋白(Aβ)是一组由39～43个氨基酸残基组成的多肽,其纤维状沉淀是AD的主要病理特征。有研究者采用Aβ25～35诱导培养的原代神经细胞建立AD模型。因此本实验采用Aβ25～35诱发原代神经细胞损伤。通过检测MTT的吸光度可以反应Aβ25～35对细胞的损伤以及LQ对损伤的保护作用。结果表明,LQ在0.1～10μmol·L-1内可以抑制Aβ25～35对海马神经细胞的损伤。有文献报道,Aβ能够导致培养的神经元凋亡,而且AD病人中多数神经元是通过凋亡途径死亡的。Aβ通过在细胞膜上形成通路或者通过激活细胞表面的相关受体而促进钙离子内流,而钙离子在学习和记忆中起到基本的作用,它也与神经元的存活与死亡相关。因此本实验以Aβ25～35诱导细胞凋亡,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,采用荧光探针检测细胞内钙离子浓度,观察了LQ对Aβ25～35诱导神经细胞凋亡的保护作用和对Aβ25～35引起胞内钙离子升高的抑制作用。结果证实,LQ的确可以有效地减轻Aβ25～35诱导的神经细胞凋亡的发生,同时可以显著降低Aβ25～35引起内钙超载。综上所述,甘草苷能够对Aβ25～35导致的大鼠原代海马神经元损伤有保护作用。文献报道,神经系统功能依赖于神经元之间良好的连接,此连接形式依赖于生长锥对环境信号反应进而引导轴突向合适的方向延伸。本实验利用原代海马神经元验证甘草苷的神经营养活性。结果表明,甘草苷在2ng·mL-1NGF存在下能够促进神经元轴突的生长,该作用能够被特异性丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶抑制剂PD98059部分阻断,故推测甘草苷可能通过激活MAPK信号通路进而延长海马神经元轴突。近年发现神经干细胞可自我更新和增殖,具有分化产生中枢神经类神经细胞的多分化潜能,在神经损伤修复和退行性疾病治疗等方面具有巨大的应用潜势。因此,本实验从出生12h内的SD大鼠乳鼠获取神经干细胞,进行分离培养和鉴定。并根据靶源性神经营养因子理论,