基于pcr方法鉴别蛇类药材真伪品的研究

基于pcr方法鉴别蛇类药材真伪品的研究

蛇药一直是动物药的重要组成部分。它经常具有驱风、通络、止痛的功效，临床应用广泛。《中国药典》2010年版中共收载了3种蛇类药材:乌梢蛇Zaocysdhumnades,金钱白花蛇Bungarusmulticinctus,蕲蛇Agkistrodonacutus。近年来,由于野生资源逐渐匮乏,加上价格昂贵,市场上出现蛇类伪品和混淆品甚多,且仅凭外部形态特征难以准确辨认。随着分子鉴定技术的引入,药典鉴别项下增加了乌梢蛇、蕲蛇的PCR鉴定,但由于药典所载方法用时较长,无法适应当前中药分子鉴定技术现场运用的需要。PCR作为分子生物学中应用最广泛的技术之一,随着研究和应用领域的不断增长,存在着相当巨大的改进空间。自Millus等发明PCR技术以来,对PCR技术的改良从未停止过。Yap等通过调整PCR条件来缩短PCR反应时间。Wittwer等通过热空气注入法快速控温,从而减少升降温的时间,并提出了快速PCR(rapidPCR)的概念。快速、准确、高通量鉴别是现代中药分子鉴别的核心需要,本文基于乌梢蛇、蕲蛇药典PCR鉴定方法和已建立的金钱白花蛇PCR鉴定方法,对这3种蛇类药材PCR鉴别技术的反应程序进行了优化,建立了快速PCR鉴别方法,并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测,同时结合药材DNA快速提取技术,可将蛇类药材真伪鉴别时间控制在30min左右,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。1材料表面1.1快速pcr研究选取来自于不同产地的11批乌梢蛇正品、12批金钱白花蛇正品、8批蕲蛇正品及其33批混伪品进行快速PCR研究。蛇类样品收集自广东、江西、北京、安徽等地区,由中国食品药品检定研究院中药标本馆张继研究员鉴定,凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心,见表1。1.2pcr扩增及成像系统GeneAmp9700型PCR扩增仪(AppliedBiosystem公司);TC-512梯度PCR仪(TECHNE公司);VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪(AppliedBiosystems公司);5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司);VORTEX-2GENIE漩涡震荡仪(Scientificindustries公司);DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂);HE99X-15-1.5型电泳槽(Hoefer公司);SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司);ZF-7A型手持式紫外灯(上海谷村电子光学仪器厂)。2方法2.1pcr反应体系取20mg蛇类药材粉末,使用碱裂解法提取总DNA,所提取DNA稀释10倍用于PCR反应。通用引物对Cytb-H/Cytb-L用于PCR反应以检测DNA质量,25μLPCR反应体系,包含2.5μL10×buffer,1μL10mmol·L-1dNTPs,0.25μmol·L-1上游及下游引物、0.25USpeedStarHSTaqDNA聚合酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液、1μL(约10ng)DNA模板,反应程序见表2。2.2pcr反应及扩增取样品DNA用于确定快速PCR反应条件。25μLPCR反应体系,包含2.5μL10×buffer,1μL10mmol·L-1dNTPs,0.25μmol·L-1上游及下游引物,0.25USpeedStarHSTaqDNA聚合酶、1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液、1μL(约10ng)DNA模板。PCR反应在GeneAmp9700型PCR扩增仪上进行,初始反应程序见表2。反应结束后取PCR反应产物5μL,加入2μL6×Loadingbuffer(Takara公司)混匀后于EB染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测,SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。分别利用蛇类特异性鉴别引物对WuShao-F/WuShao-R,JinQian-F/JinQian-R,QiShe-F/QiShe-R进行PCR反应,并考察退火温度:61,63,65,67,69,71℃(乌梢蛇,蕲蛇);60,62,64,66,68,70℃(金钱白花蛇);PCR循环数:30,28,26,24,22个循环;变性温度:94,92,90,88,86,84℃;变性和退火时间:20,10,5,3,1s;Taq酶种类:rTaqDNA聚合酶,SpeedStarHSTaqDNA聚合酶,AptaTaqfastDNA聚合酶Mix,TransfastTaqDNA聚合酶;不同PCR仪:9700型PCR仪(ABI公司),VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪(AppliedBiosystems公司),TC-512型PCR仪(TECHNE公司)。2.3pcr产物检测在PCR扩增产物中加入2μL100×SYBRGreenI于365nm紫外波长下检测荧光,出现绿色荧光则表明存在阳性扩增产物。3结果与分析3.1dna质量检测由于碱裂解法提取的DNA无法通过凝胶电泳检测,本文使用通用引物进行扩增,以检测所获得DNA质量。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,3种蛇类药材及其20个混淆品均获得约400bp大小的扩增产物,见图1,说明碱裂解法提取的DNA可以满足PCR反应的要求。3.2不同条件对pcr扩增效果的优化为建立准确、快速、简便的蛇类药材分子鉴别方法,本文对已报道的PCR反应体系进行了优化,在最初的25μLPCR反应体系中加入1μL20%PVP40溶液、0.5μL10g·L-1BSA溶液,可显著增加PCR反应的成功率。由于Yap等研究表明,低温预变性(92℃1min)即可实现全基因组解链并能增加PCR产物得率,且本课题组前期证实94℃预变性1min即可实现PCR产物的有效扩增,因此本文把PCR初始程序设计为94℃预变性1min,从94℃变性开始,两步法,30个循环,并开展PCR反应条件的优化。在此基础上进一步依次对PCR反应过程中退火温度、变性温度、变性和退火时间、循环次数进行优化,并分析了Taq酶种类及不同的PCR仪对改良后PCR反应稳定性的影响。对乌梢蛇快速PCR反应条件进行优化,使用GeneAmp9700型PCR扩增仪、TC-512梯度PCR仪均可,反应参数为88℃预变性1min后,88℃10s,63℃10s,26个循环,见图2。金钱白花蛇快速PCR变性时间可以减至1s,但变性1s时,退火时间低于20s无法获得有效扩增。金钱白花蛇快速PCR反应参数为88℃预变性1min后,88℃5s,62℃5s,28个循环,见图3。蕲蛇快速PCR反应参数为88℃预变性1min后,88℃3s,63℃3s,26个循环,见图4。3.3快速pcr和紫外荧光检测分别选择优化的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇快速PCR反应参数,对3种蛇类药材及其18种混伪品进行快速PCR扩增,在扩增产物中加入2μL100×SYBRGreenI,在365nm紫外波长下进行荧光检测。结果表明,正品显示出明亮绿色荧光,而伪品不发出荧光,见图5。4动物类药材鉴定难本实验主要针对药典收载的3种蛇类药材,建立快速PCR鉴别方法,经DNA提取、PCR扩增、荧光检测3步骤,在30~45min可完成药材真实性快速鉴别,有利于实现中药材分子鉴别的现场运用。目前动物类中药材鉴定,尤其是现场鉴定,主要还是依赖传统性状和理化鉴别,其针对形状完整、真伪品化学组成相差较大的样品鉴别确实更直接、简便。但大部分动物类药材多以粉末或成药方式入药;且存在外部形态被破坏、组织细胞特征不够明显、化学成分无明显差异等鉴定难点,需要依靠经验丰富的专业人才;由于目前动物药鉴定和分类学的专业人员较少,传统中药鉴定难免存在主观性强、重复性和稳定性差等缺陷等问题。经典PCR鉴定技术恰好拥有准确、专属性强、重现性好等优点,但由于其自身操作相对复杂、单次反应耗时较长,难以用于中药材现场鉴别。快速PCR技术可在确保PCR反应灵敏度和特异性的前提下尽可能缩短PCR时间、提高检测效率,在临床检验和司法检测中已应用广泛[16,17,18,19,20,21]。快速PCR可以通过对经典PCR反应条件进行优化,结合DNA快速提取技术和荧光检测技术,操作简单、结果判读明确,在动物类药材的鉴定中具有很强优势,也适用于真伪鉴定试剂盒的开发,有助于实现中药材准确、快速、现场鉴定。1.3taqna聚合酶琼脂糖购自Promega公司;溴