苜蓿根瘤菌accc17631和accc177菌株培养基配方优化

苜蓿根瘤菌accc17631和accc177菌株培养基配方优化

紫草是世界上最大的科剧作家，被称为“繁殖之王”。它丰富、高含量和良好的口感可以解决水产养殖中蛋白质和食物不足的问题。研究表明,播种前对苜蓿进行根瘤菌接种,可增加苜蓿的出苗率、抗病虫害能力,明显提高牧草产量以及营养价值。接种根瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项技术措施,在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出售,应用面积不断扩大。为了适应中国苜蓿根瘤菌肥生产的需求,本研究通过单因素试验和正交试验优化筛选最适合苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)生长的碳源、氮源及培养基配方,由于不同的根瘤菌对其培养基中的最佳碳氮源的选择存在差异,故选择2株苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676作为供试菌株进行对比,以期为苜蓿根瘤菌今后的研究与菌肥生产提供科学依据。1材料和方法1.1生长特性菌株及其特性:快生型苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676,由中国农业微生物菌种保藏中心提供。2株菌均属于苜蓿中华根瘤菌,菌体小杆状,在根瘤菌培养基上菌落为圆型、乳白色、半透明,边缘整齐,有粘质,在B.T.B反应中产酸,在石蕊牛奶中均凝结。2株根瘤菌在pH4.0～9.0范围内均能生长。根瘤菌ACCC17631在含盐量为4.0%NaCl的YMA培养基中生长正常,ACCC17676耐盐性略差,在含盐量3.5%NaCl的YMA培养基中生长正常,2株菌均适合华北、东北、西北等盐碱土地区接种使用。培养基:YMA液体培养基(g·L-1):甘露醇10,K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4·7H2O0.2,酵母粉0.8,NaCl0.1,蒸馏水1000mL,pH6.8～7.0。1.2培养基碳源的筛选菌种活化:在斜面培养基上28℃培养48h后,接种到YMA液体培养基中,28℃,150r·min-1转速的摇床中震荡培养48h制成接种液。培养基碳源的筛选:YMA培养基中分别用等量蔗糖、葡萄糖、甘露醇及麦芽糖作为碳源,培养基其他部分保持不变。将活化菌液按1%(V/V)接种量接入装有50mL液体培养基的100mL三角瓶中,28℃,150r·min-1震荡培养。培养期间用分光光度计每6h测定菌液OD600nm吸光度值,连续测定60h,分别绘制苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676在不同碳源下的生长曲线并选出各自的最佳碳源,每处理均重复4次。培养基氮源的筛选:YMA培养基中分别用等量酵母粉、蛋白胨、大豆粉作为氮源进行试验,培养基其他成分不变。将活化菌液按1%(V/V)接种量接入装有50mL液体培养基的100mL三角瓶中,28℃,150r·min-1震荡培养。用分光光度计测定OD600nm值,绘制苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676在不同氮源下的生长曲线并选出最佳氮源。正交试验:根据上述单因子试验得出结果,对选定的碳源、氮源、磷源以及MgSO4·7H2O这4种主要成分进行L9(34)正交试验,培养48h后,用分光光度计测定OD600nm值,分析4种物质对苜蓿根瘤菌的影响度及最佳剂量组合。验证试验:用已筛选得到的最佳培养基与试验中OD600nm值最高的培养基进行比较,验证正交试验的结果。2结果与分析2.1双组分生长效果碳源是根瘤菌培养基中必不可少的组成成分,是构成根瘤菌细胞和代谢产物中碳架来源的重要营养物质,因此对根瘤菌培养基中碳源进行筛选对根瘤菌生长有至关重要的作用。蔗糖、葡萄糖、甘露醇以及麦芽糖4种常见碳源对苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676生长的影响结果如图1和图2所示。不同碳源对苜蓿根瘤菌ACCC17631和ACCC17676生长具有不同的影响。根瘤菌ACCC17631在蔗糖和甘露醇为碳源的培养基中生长较好,且蔗糖略优于甘露醇,生长60h后,其OD600值最高分别达到1.884和1.819。在葡萄糖为碳源的培养基中生长缓慢,对数生长时间短,其OD600值最高达到1.203,在以麦芽糖为碳源的培养基中生长最差,其OD600值最高仅达到0.745。根瘤菌ACCC17676在蔗糖为碳源的培养基中生长最好,其OD600值高达1.920,在甘露醇中生长次之,60h后OD600值为1.563,在以葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基中生长较差。由于甘露醇在生产成本上远高于蔗糖,所以选择蔗糖作为ACCC17631和ACCC17676根瘤菌培养基进一步优化的碳源。2.2accc1731在大豆粉培养基中的生长情况氮源对比试验结果如图3和图4所示。根瘤菌ACCC17631在大豆粉为氮源的培养基中的生长速度远快于在其他氮源中的生长速度,60h后,ACCC17631在大豆粉中的OD600值达到2.129,在蛋白胨中却仅为1.164。由图4可知,根瘤菌ACCC-17676在以酵母粉为氮源的培养基中生长效果最好,OD600最高达到2.079,大豆粉次之,其OD600最高达到1.9055,蛋白胨的利用效果最差。故选择大豆粉作为根瘤菌ACCC17631培养基进一步优化的氮源,而选酵母粉作为根瘤菌ACCC17676培养基中的最优氮源。2.3培养基的营养成分对accc17651发酵的影响在筛选培养基碳源、氮源的基础上,对培养基的主要成分:蔗糖、大豆粉(酵母粉)、K2HPO4/KH2PO4和MgSO4·7H2O做正交设计试验,进一步优化确定最佳组合剂量。正交设计方案及结构如表1所示。结果表明:ACCC17631在3号配方的培养基中生长速度最快,其次为6号培养基(表1);由表2所示方差分析结果表明:大豆粉、K2HPO4/KH2PO4和MgSO4·7H2O对根瘤菌ACCC17631的活菌数影响极显著(F>F0.01);蔗糖对其影响不显著(F<F0.05)。表3所示极差分析结果表明:ACCC17631在优化培养基中培养时,4种营养成分对其生长速度影响顺序是:酵母粉(B)>MgSO4·7H2O(D)>K2HPO4/KH2PO4(C)>葡萄糖(A),最佳表现组合为A3B3C1D3,即蔗糖20g,大豆粉2.4g,K2HPO40.25g,KH2PO40.25g,MgSO4·7H2O0.2g;ACCC17676在8号配方的培养基中生长速度最快,其次是6号培养基(表1)。表4所示方差分析结果表明:蔗糖、大豆粉、K2HPO4/KH2PO4以及MgSO4·7H2O对根瘤菌ACCC17676的活菌数影响均极显著(F>F0.01)。而表3所示极差分析结果表明:ACCC17676在优化培养基中培养时,4种营养成分对其生长速度影响的顺序是:MgSO4·7H2O(D)>酵母粉(B)>葡萄糖(A)>K2HPO4/KH2PO4(C),最佳表现组合为A3B3C1D3,即蔗糖20g,酵母粉2.4g,K2HPO40.25g,KH2PO40.25g,MgSO4·7H2O0.2g。2.4生长速度的比较对正交试验得出的优化培养基与它们的常规培养基及2株供试菌株在正交试验中生长速度最快的3,8,6号培养基进行验证,结果如图5和图6所示。根瘤菌ACCC17631培养60h后在优化培养基和3号培养基中的生长速度相近,OD600值分别为2.126和2.092,在6号培养基中的OD600值为1.99,均高于常规培养基YMA中的1.438;同样根瘤菌ACCC17676培养60h后测定的优化培养基和正交试验8号培养基的OD600值分别为2.123和2.002,而对照YMA只有1.694,根瘤菌ACCC17631和ACCC17676的生长曲线(图5和图6)更进一步说明筛选出来的优化培养基优于常规YMA培养基。3培养基组分的优化目前,国内外关于根瘤菌培养基优化的研究主要集中于大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)等经济作物,对豆科牧草,特别是紫花苜蓿的研究鲜见报道。苜蓿根瘤菌的常规培养基是YMA培养基,但由于YMA培养基是半合成培养基,用于大规模发酵生产时,成本较高。本研究在YMA培养基的基础上针对碳源、氮源以及培养基的其他主要成分做出了优化。碳源、氮源的利用试验表明,蔗糖和甘露醇是2株供试菌株比较理想的碳源,但是蔗糖价格相对较低,故选蔗糖作为碳源更加经济高效。而大豆粉和酵母粉分别是根瘤菌ACCC17631和ACCC17676最佳的氮源选择。正交试验以及优化培养基的验证试验得出根瘤菌ACCC17631(ACCC17676)的最佳培养基配方(g·L-1):蔗糖20,K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4·7H2O0.2,大豆粉(酵母粉)2.4,NaCl0.1,pH6.8～7.0。另外,通过2株供试菌株的对比试验证明,苜蓿