第3单元 免疫凝集类实验

第三单元免疫凝集类实验

验证实验一直接凝集实验颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。本实验以试管法凝集试验——肥大试验（Widaltest）验证凝集反应及其特点。

Widaltest原理

将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其相对含量。实验器材和材料器械

试管、吸管、恒温水浴箱等试剂

抗体待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原伤寒沙门菌诊断菌液（7×108/ml)、生理盐水实验方法（Widaltest）

取试管7支，依次编号并做好标记。每支试管中加生理盐水0.5ml。倍比稀释血清：

取1∶20稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。

加诊断菌液：

每管加伤寒沙门菌H或O诊断菌液0.5ml，此时各管血清最终稀释度依次为1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560摇匀后置37℃水浴2～4h，取出观察结果或放室温过夜，次日观察结果。试管凝集法操作程序试管号1234567生理盐水（ml)0.50.50.50.50.50.50.5待测血清（ml)0.50.50.50.50.50.5伤寒O菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5血清稀释度1:801:1601:3201:6401:12801:25600.50.50.50.50.5弃掉0.5结果

1234567菌液试管凝集试验原理

结果判断实验结果 将试管置于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用++++、+++、++、+、-等符号记录凝集效价。对照管：应无凝集现象试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底

“+++”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底

“++”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底

“+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集

“-”：不凝集，液体浊度与对照管相同血清抗体效价：试验管出现“++”以上的凝集现象即可判断为阳性；以出现“++”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。注意事项凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时，须加大抗体稀释倍数重新试验。直接凝集试验也可以用玻片法以鉴定伤寒沙门菌为例：取洁净载玻片2张，在玻片的左上角分别标明“1”、“2”；加入已知抗体（伤寒沙门菌诊断血清）和待测菌液（伤寒沙门菌或其他细菌）。1生理盐水

+伤寒杆菌

1:40伤寒杆菌诊断学清

+

伤寒杆菌2生理盐水

+大肠杆菌

1:40伤寒杆菌诊断学清

+

大肠杆菌玻片凝集试验鉴定伤寒沙门菌

玻片凝集试验(slideagglutinationtest)颗粒性抗原与相应抗体直接结合

出现肉眼可见的凝集现象

在玻片上YYY+

？Y+

将载玻片置黑色背景上观察。在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性结果。肉眼观察不够清晰者，可在低倍镜下观察。

结果分析实验讨论肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝集现象。临床上开展的外斐反应是利用与立克次体有共同耐热性多糖抗原的变形杆菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次体作为已知抗原，与患者血清进行凝集试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立克次体疾病。现有OX19、OX2、OXk三种诊断菌液和待测血清，请写出利用试管凝集法进行的外斐试验的操作步骤。思考题为什么临床上不直接利用立克次体作为已知抗原进行血清学诊断呢？

验证实验二间接凝集实验

间接凝集实验（indirectAgglutinationTest)

将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关、大小均匀的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后再与相应抗体（或抗原）结合，在适当电解质存在的条件下，载体颗粒被动地发生凝集，出现肉眼可见的凝集现象。

以胶乳凝集试验检测类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）为例验证间接凝集实验的原理和特点

实验原理

类风湿因子（RF）是一种抗变性IgG的自身抗体，具有与人或动物变性IgG结合的特点。将处理过的人IgG与聚苯乙烯胶乳颗粒结合成致敏颗粒，当待测血清中含有RF时，则与致敏颗粒上变性的IgG发生反应，出现凝集现象。胶乳颗粒人IgG致敏致敏胶乳NS凝集颗粒待测RF实验器材

器械 黑色方格反应板、毛细滴管、试管、试管架、吸耳球、恒温水浴箱等试剂 人IgG致敏胶乳试剂（市售类风湿因子检测试剂） 类风湿因子阳性血清和阴性血清：临床标本筛选获得

待测血清

实验方法

待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水作1∶20稀释。在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别滴加稀释待测血清、阳性血清、阴性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏胶乳试剂1滴。连续轻轻摇动反应板，2～3分钟后观察结果。结果判断

若胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性反应胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性反应注意事项试剂应4℃保存，严禁冻结，用时摇匀；所有试验器皿和反应板均应洗净、干燥；若阴性对照出现凝集，则表示致敏乳胶试剂有质量问题，不能使用。实验结果分析和讨论胶乳凝集试验方法简便、快速，但易发生非特异性凝集反应，试分析如何判定实验的非特异性凝集反应。判断凝集或凝集程度除目测外，是否还有其他方法？验证实验三间接凝集抑制实验概念间接凝集抑制试验（indirectagglutinationinhibitiontest）是以抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测标本中是否含有与致敏抗原相同的抗原的试验。检测时先将抗体试剂与待测标本混合，再加入抗原致敏的载体。若标本中没有与抗体试剂相对应的抗原，则抗体试剂与随后加入的致敏载体上的抗原结合而出现凝集；若标本中存在与抗体试剂相对应的抗原，抗体先与之结合，随后加入的致敏载体上的抗原则无抗体结合，凝集反应被抑制。本实验以检测尿绒毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫诊断试验为例进行胶乳凝集抑制现象的观察和验证。实验原理

孕妇尿液中含有HCG，正常人尿中无HCG。当向孕妇尿中加入一定量抗HCG抗体时，尿HCG即与抗HCG发生抗原抗体反应，此时，再加入胶乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯胶乳颗粒），因抗体被消耗，故不能发生凝集，即凝集被抑制，为凝集抑制试验阳性；反之，若待检尿中无HCG（非妊娠尿），则加入的抗HCG抗体未被结合和消耗，可与随后加入的乳胶抗原发生反应，出现肉眼可见的细小颗粒，即凝集未被抑制，为凝集抑制试验阴性。待测尿液(含HCG)抗HCG特异结合抗原抗体复合物NS＋致敏胶乳无凝集颗粒为阳性待测尿液(无HCG)抗HCG无结合NS＋致敏胶乳有凝集颗粒为阴性实验器材和材料器械 黑色方格反应板、毛细滴管试剂与标本胶乳抗原（HCG致敏的胶乳颗粒）、抗HCG抗体（商品化）孕妇尿液、正常人尿液、待测尿液。生理盐水实验方法在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别加待测尿液、孕妇尿液、正常人尿液（或生理盐水）1滴，然后每格加抗HCG抗体1滴，轻轻摇动1～2min。于上述3格中各滴加胶乳抗原1滴，轻轻摇动2～3min后观察结果。结果判断如肉眼观察结果不清楚，可用显微镜在低倍镜下观察样本待测尿液孕妇尿液正常人尿(或NS)现象凝集或不凝集不凝集凝集结果判定非妊娠尿或妊娠尿阳性对照阴性对照

注意事项待测尿液宜采用晨尿，不能及时检测检测的标本应保存于2~8℃，不能使用严重蛋白尿、血尿、菌尿标本；试剂应4℃保存，切勿冻存。使用前使试剂接近室温并摇匀；应同时设置阳性、阴性对照，以排除非特异性凝集；所加液滴应大小一致；结果应在强光下观察，观察时应置黑色背景下或稍倾斜反应板。实验结果分析和讨论妊娠免疫诊断试验是临床常用的经典胶乳凝集抑制试验，操作简便、快速、特异性强，停经35～40天以上的孕妇可测得阳性结果。需注意的是，绒毛膜上皮癌、葡萄胎及睾丸畸胎瘤病人尿中HCG含量远较正常妊娠尿液为高，将尿液作1∶200稀释后仍可呈阳性反应。待测尿液以晨尿为好。测试时应注意标本及各诊断试剂加入的顺序，并设立阳性和阴性对照。试分析若随意变更加样顺序，如先加标本、再加胶乳抗原，最后加抗HCG或先加胶乳抗原、再加抗HCG，最后加标本，结果如何？

凝集抑制试验可用于确证呈阳性反应的间接凝集实验是否是非特异凝集反应，试讨论如何进行该项实验？

不完全抗体检测的实验设计（设计性实验）

实验目的

采用红细胞作为凝集试验的抗原，创造条件设法使相邻的红细胞靠近、聚拢、凝集从而达到对红细胞不完全抗体的检测目的。问题背景资料

抗体与相应抗原结合后，在适宜的介质参与下可出现可见的抗原抗体反应。但有些分子较小的7S的IgG类抗体，体积小，长度短，在适宜介质中与相应抗原结合后不出现可见反应，这种抗体称为不