酶组织化学各论

酶组织化学各论一、碱性磷酸酶

碱性磷酸酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解。其反应通式如下：1.钙-钴法光镜显示方法

（1）钙-钴法的原理碱性磷酸酶将磷酸盐的底物分解产生磷酸离子为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，加入硝酸钴，使之转变为磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀，以显示酶活性所在部位。（2）孵育液的配制：

3％β-甘油磷酸钠10ml（底物）

2％巴比妥钠10ml（缓冲液）

2％氯化钙20ml（捕获剂）

5％硫酸镁5ml（激活剂）

D.W5ml

孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。

（3）操作步骤：

①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林

固定10min，或不固定）

②入孵育液，37℃孵育30～60min

（磷酸钙沉淀形成）

③蒸馏水冲洗5min

④置2％硝酸钴内2min（磷酸钴形成）

⑤蒸馏水冲洗

⑥置1％硫化铵溶液内1min（硫化钴形成）

⑦蒸馏水冲洗

⑧甘油明胶封固（非脂溶剂稳定沉淀）（4）结果与评价：碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散，故定位欠准确。

（5）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法。2.偶氮-偶联法光镜显示方法

（1）偶氮色素法的原理偶氮色素法是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚，以偶氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使用β－磷酸萘酯，通过酶的作用，水解生成的β－萘酚，后者为重氮盐捕捉，生成红色的偶氮色素沉淀。（2）孵育液的配制：

萘酚AS（或萘酚AS-MX）10～25mg（底物）

N，N-二甲基甲酰胺液

0.5ml（促溶剂）

0.2mol/LTris－盐酸（pH9.2）

50ml（缓冲液）

坚牢蓝B

50mg（捕获剂）

以上混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整pH9.0～9.2值。

（3）操作步骤：

①新鲜组织，作冰冻切片；

②入孵育液，37℃或室温

5～60min

（有色沉淀形成）

③双蒸馏水冲洗3～5min

④4％甲醛，室温下固定10～50min

⑤蒸馏水冲洗

3～5min

⑥甘油明胶封固。（脂溶性沉淀）

（4）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同

萘酚法有三个优点：①反应产物溶解度小，局部比较明显；②萘酚化合物能比较快地被水解，可缩短孵育的时间；③反应产物立即可见，并显示出颜色。3.柠檬酸铅电镜显示法

（1）预处理：

①固定：2％戊二醛（0.1mol／L二甲胂酸缓冲液，8％蔗糖，PH7.2～7.4），固定60min；或4％多聚甲醛固定数小时至12h。

②切片：冰冻切片机或振动切片机切片40～50um。（2）孵育液的配制：

0.2mol／LTris-HCl（pH8.5）

1.4ml（缓冲液）

3％β-甘油磷酸钠2.0ml（底物）

0.015mol／LMgSO4液2.6ml（激活剂）

蔗糖0.5g（和缓剂）

0.5％柠檬酸铅4.0ml（捕获剂）

共计10ml（pH9.0～9.4）（3）方法与步骤：

①新鲜组织，或甲醛固定并作冰冻切片40um；

②入孵育液，37℃，孵育15～30min；

③蒸馏水洗；

④冷1％锇酸（OsO4），30min；

⑤蒸馏水洗；

⑥梯级酒精脱水；

⑦环氧树脂包埋，超薄切片，电子染色；

⑧电子显微镜观察。（4）结果与评价：磷酸铅呈现高电子密度颗粒，主要分布在细胞膜上。

（5）对照：孵育液中去除底物或加入抑制剂（如β苯丙氨酸或四唑或溴四唑），则酶活性为阴性。二、酸性磷酸酶

酸性磷酸酶是一种在酸性环境下能水解磷酸单酯的酶。其反应通式与碱性磷酸酶相同。

酸性磷酸酶活性的检查法一般可分为金属盐法和偶氮色素法。1.金属盐光镜显示方法

（1）显示原理

显示酸性磷酸酶的铅法其基本机制类似于显示碱性磷酸酶的钙-钴法，但因磷酸钙在酸性溶液中是可溶性化合物，故改用硝酸铅作捕获剂，最后与硫化铵作用生成棕色硫化铅沉淀。（2）孵育液的配制：

3％β-甘油磷酸钠1ml（底物）0.05mol醋酸盐缓冲液（pH5.0）

10ml（缓冲液）

蔗糖0.8mg（和缓剂）

硝酸铅10mg（捕获剂）

孵育液最终pH值5.0，新鲜配制尽快使用。（3）操作步骤：

①新鲜组织，作冰冻切片或石蜡切片

②10％福尔马林固定10min

③蒸馏水洗

④入孵育液，37℃2～4h（磷酸铅形成）

⑤双蒸馏水洗2～3min

⑥入1％硫化铵液（新鲜配制）1～2min

（硫化铅形成）

⑦蒸馏水冲洗；

⑧甘油明胶封固。（非脂溶剂稳定沉淀）（4）结果与评价：反应阳性部位呈棕褐色硫化铅颗粒。该酶是可溶性酶，以冷固定后结果较满意。

（5）对照：①去底物对照；②抑制剂对照：特异性酶抑制剂是氟化钠（NaF，4.2mg／10ml）。2.偶氮色素光镜显示方法

（1）显示原理

酸性磷酸酶是使底物的醇部分脱磷酸化，以偶氮色素的形式捕捉。以萘酚或其衍生物磷酸酯作为底物，经酶作用游离出萘酚或其衍生物，与重氮盐作用形成偶氮色素，显色于酶活性部位。（2）孵育液的配制：

萘酚AS-BI磷酸盐5mg（底物）

溶于二甲基甲酰胺液0.25ml（促溶剂）

10％氯化镁2滴（激活剂）

蒸馏水25ml

0.2mol醋酸盐缓冲液（pH5.2～5.6）

25ml（缓冲液）

红紫罗兰IB盐30mg（捕获剂）

（或其他重氮盐）

以上充分搅拌、溶解、过滤后使用。（3）操作步骤：

①新鲜组织，甲醛钙固定10min

②冰冻切片或石蜡切片

③蒸馏水洗1～2min

④入孵育液，37℃10～60min（有色沉淀形成）

⑤双蒸馏水漂洗2～3min

⑥l％甲基绿1～2min（复染细胞核）⑦蒸馏水漂洗1～2min

⑧甘油明胶封固。（脂溶性沉淀）（4）结果与评价：红色颗粒为酶活性部位。

（5）对照：采用去底物实验。3.电镜显示法

（1）预处理：

①固定：2％戊二醛（0.1mol/L二甲胂酸盐缓冲液，8％蔗糖，pH7.2～7.4）固定60min；

②切片：冰冻切片机切片或振动切片机切片40～50um。（2）孵育液的配制：

醋酸盐缓冲液0.1mol／L（缓冲液）

对硝基酚磷酸钠3.0mmol／L（底物）

硝酸铅3.6mmol／L（捕获剂）（3）方法与步骤：

①新鲜组织，预固定并作冰冻切片40um；

②入孵育液，37℃，10～20nim（磷酸铅沉淀形成）

③冷1％四氧化锇液后固定；

④95％乙醇脱水；

⑤环氧树脂包理；超薄切片；电子染色；

⑥电子显微镜观察。（4）结果与评价：阳性沉集物为高电子密度颗粒。

（5）对照：去底物对照，抑制剂对照，硝基酚磷酸钠。

5.酸性磷酸酶的生物学意义

酸性磷酸酶广泛分布于生物体内，一般认为酸性磷酸酶位于溶酶体，是溶酶体的标志酶。三、三磷酸腺苷酶

ATP酶为水解ATP产生ADP和磷酸的酶。ATP酶种类繁多，重要的ATP酶有：

（1）细胞膜ATP酶Na+、K+-ATP酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶。

（2）肌球蛋白ATP酶因它可被Ca2+激活，故又称为Ca2+-ATP酶。

（3）线粒体ATP酶Mg2+-ATP酶可被Mg2+所激活。

（4）溶酶体膜ATP酶H+、K+-ATP酶。硝酸铅法显示Mg2+激活的三磷酸腺苷酶（Mg2+-ATPase）

（1）原理：ATPase水解磷酸之间的高能键，释放大量能量，而不能水解磷酸与碳之间的键。释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，经硫化铵处理形成硫化铅沉淀显色。（2）孵育液的配制：

三磷酸腺苷二钠10mg（底物）

0.2mol/LTris-HCl（pH7.2）

10ml（缓冲液）

0.1mol/LMgSO42.5ml（激活剂）

2％Pb(NO3)21.5ml（捕获剂）

蔗糖1.8g（和缓剂）

双蒸馏水加至25ml

配制时Pb(NO3)2要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色透明或过滤后使用。（3）操作步骤：

1）新鲜组织，冰冻切片；

2）冷10％福尔马林固定10～20min

3）蒸馏水冲洗2～3min

4）入孵育液，37℃，孵育10～60min

（磷酸铅沉淀形成）

5）蒸馏水洗2～3min

6）入1％硫化铵1min（硫化铅沉淀形成）

7）蒸馏水洗；

8）甘油明胶封固。（非脂溶剂稳定沉淀）（4）结果与评价：酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。电镜下阳性沉集物为高电子密度颗粒。（5）对照：

①除去底物，则反应为阴性；

②以β-甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。四、非特异性酯酶

1．反应原理

（1）偶氮色素法在酶的作用下，从底物游离出来的α-萘酚（或β-萘酚、萘酚AS衍生物）与重氮盐偶联形成偶氮色素，同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素的显色，可以证明酶的存在部位。（2）嗜锇性硫酯法在酶作用下，底物硫酯被水解后，游离出的硫酚（含-SH）立即与坚牢蓝BBN相偶联，形成嗜锇酸性偶氮硫醚。经锇处理偶氮硫醚即形成电子密度高的锇黑。S-乙酰基-2-巯基苯酰替苯胺（TAB）（3）硫代乙酸法在酶的作用下，底物硫代乙酸游离出的硫化氢与铅反应成为硫化铅而沉着。此法的原理也应用于电镜证明法。反应原理如下：

酯酶Pb(NO3)2

CH3COSH—→CH3COOH+H2S—→PbS↓2．α-萘基乙酸酯法

1）孵育液的配制：

α-萘基乙酸酯10mg（底物）

丙酮0.25ml（促溶剂）

0.1mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.4）

20ml（缓冲液）

坚牢蓝B盐50～100mg（捕获剂）

搅拌过滤使用。2）操作步骤：

①新鲜组织恒冷箱切片，福尔马林固定；

②入孵育液，室温或37℃10～20min

（有色沉淀形成）

③流水洗3～5min

④Mayer苏木精染色4～6min（核复染）

⑤流水冲洗5～6min

⑥甘油明胶封固。（脂溶性沉淀）3）结果与评价：酶活性部位呈黑色，胞核呈暗褐色。4.非特异性酯前的生物学意义非特异性酯酶主要定位于内质网和溶酶体，也可能有少量存在于线粒体和胞液内。因此，光镜下整个细胞质显示了酶活性的染色反应。非特异性酯酶生理功能尚不清楚，目前认为主要参与酯类物质代谢，也与蛋白质代谢活动有关系。

适用于：睾丸，卵巢，肾上腺，巨噬细胞等的研究。五、碳酸酐酶

1．反应原理

目前，组织化学中显示碳酸酐酶的方法有三种：

1）用同位素标记的抑制剂与酶相结合的放射自显影术；

2）应用抗体的免疫组织化学法；

3）酶反应物的金属盐沉淀法。现在最常用的是金属盐反应法。2．光镜显示法

（1）孵育液的配制：

溶液Ⅰ：

0.1mol／LCoSO40.5～5ml（捕获剂）

0.5mol／LH2SO43ml（中和剂）

0.067mol／LKH2PO40.5ml（缓冲液）

蒸馏水加至总量8.5ml溶液Ⅱ：

NaHCO3380mg（底物）溶于双蒸馏水20ml中（使用前新鲜配制）临用前将溶液Ⅰ与溶液Ⅱ混合，搅拌4min，再静置4min，然后移至玻璃培养皿中待用。注意搅拌时间需一致，以保反应结果稳定。（2）步骤：

①取材：新鲜冰冻切片；

②固定：可用多聚甲醛或戊二醛，如：

1％～2％戊二醛二甲胂酸钠缓冲液中固定1～2h再分别以8％、10％、24％蔗糖溶液泡过夜，然后洗净（未经固定的组织，其CAH活力可减低5％～10％）；③切片：新鲜组织或经固定的组织块用恒冷切片机切片，10～20um

④孵育：孵液中漂浮，室温下4～12min

（无色氢氧化钴沉淀形成）

⑤洗涤：蒸馏水洗，再以0.01molNa2HPO3或K2HPO3洗1～3min

⑥2％硫化铵1～2min（有色沉淀形成）⑦洗涤：先用蒸馏水，再用0.01mol／LpH4.3的醋酸水溶液轻洗切片；

⑧甘油明胶封片，光镜镜检。（非脂溶剂稳定沉淀）4.生物学意义碳酸酐酶是催化CO2水合反应和碳酸脱水反应的酶。此酶多见于胃腺的壁细胞、主细胞、肾小管（近曲小管基底部和管腔面刷状缘、远曲小管基底部）、集合小管、小肠吸收上皮、红细胞、破骨细胞中，在哺乳动物的神经胶质细胞中，该酶与神经冲动的传导有关。六、过氧化物酶

1.反应原理

过氧化物酶催化的反应中有两种底物，即受氢体和供氢体。前者的代表为过氧化氢，后者的代表为联苯胺系列的试剂，其反应的通式如下：

AH2＋H2O2―――→HA＋2H2O

供氢体供氢体的氧化物当最后形成供氢体的氧化物时，一些供氢体的氧化物会呈色，主要是外源性供氢体，如DAB、TMB。供氢体因氧化而显色。目前多采用联苯胺系列的试剂作为供氢体，如DAB、TMB等。2．显示方法

（1）孵育液的配制：

孵育液Ⅰ：

DAB·4HCl10mg（底物＋显色剂）

溶于蒸馏水5ml

0.2mol／L磷酸缓冲液（pH6.5～7.0）5ml

l％H2O20.1ml（底物）

此种孵育液特别适于组织过氧化物酶的显示孵育液Ⅱ：

DAB·4HCl5mg（底物＋显色剂）

0.05mol／LTris-HCl（pH7.6）

10ml

1％H2O20.1ml（底物）

此种孵育液特别适于辣根过氧化物酶的显示（2）步骤：

1）固定：4℃下，30min（3％戊二醛固定液：20％戊二醛15ml或25％戊二醛12ml，0.2mol／L磷酸缓冲液或二甲胂酸缓冲液50ml，蒸馏水加至100ml）。

2）浸洗：用固定液中使用的缓冲液浸洗三次以上，每次15min，或浸洗过夜；3）冰冻切片，厚度为5～10um；

4）预孵育：室温下10～30min；

5）孵育液，室温，5～60min；

6）蒸馏水漂洗，亚甲蓝染核；

7）甘油明胶封片。2.结果与评价：一般DAB法酶活性阳性部位呈棕褐色，TMB法反应呈深蓝色。

3.对照：去H2O2。4.生物学意义过氧化物酶是一种氧化还原酶。与过氧化氢酶、细胞色素氧化酶有相似的化学本质，即都属于血红素类蛋白质，它们都有相同的辅基，即铁卟啉。过氧化物酶和过氧化氢酶的催化机制是相似的，都可使过氧化氢分解，且两者都存在于过氧化物酶体之中。

但两者也有差别：

过氧化氢酶：催化H2O2，生成水，并释放出O2，实际上是一种氧化还原反应，供氢体和受氢体都是过氧化氢。即一分子H2O2被氛化成O2，而另一分子H2O2则被还原成水：

过氧化氢酶

H2O2+H2O2――――→2H2O+2O2

过氧化物酶：H2O2还