菊苣多糖体外抗氧化能力及抗疲劳作用

菊苣多糖体外抗氧化能力及抗疲劳作用付爱叶;王俏娜;吴雨龙;周峰;汪振炯;王仁雷;华春【摘要】目的:研究菊苣多糖(chicorypolysaccharide,CP)体外抗氧化能力及抗疲劳作用.方法:通过测定CP对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除作用、还原力及其体外抗氧化能力以小鼠耐力实验(负重游泳)和生化改变的检测评价CP的抗疲劳功效结果:当浓度为2.4mg/mL时CP对羟自由基、超氧阴离子自由基及DPPH自由基清除率分别为40.93%、67.11%和58.17%,还原能力稍低于同浓度VC;与空白组相比，口服CP组小鼠负重游泳时间明显延长，且血尿素氮、血清乳酸和丙二醛水平显著降低(pv0.05),超氧化物歧化酶、肝糖原和肌糖原水平显著升高(pv0.05).结论:CP具有较强的抗氧化能力和抗疲劳作用.％Objective:Tostudytheinvitroantioxidantactivitiesandanti-fatigueeffectofchicorypolysaccharide.Methods:ThescavengingactivityofCPagainsthydroxylradical,superoxideanionradical,superoxideanionradicalanditsreductionforceweremeasuredtoevaluatetheirantioxidantactivitiesinvitro.Theanti-fatigueeffectofCPwasevaluatedbyendurancetest(weight-bearingswimming)andbiochemicalindicatorschangesinmice.Results:Attheconcentrationof2.4mg/mL,thehydroxylradical,superoxideanionfreeradicalandDPPHfreeradicalscavengingratesofCPwere40.93%,67.11%,58.17%,respectively,whilethereducingcapacityofCPwasslightlylowerthanthesameconcentrationofVC.Comparedwiththeblankcontrolgroup,theswimmingtimeofCP-treatedmicewasprolonged,andthelevelsofbloodureanitrogen,serumlacticacid,andmalondialdehydeweresignificantlydecreased(pv0.05),superoxidedismutase(SOD),hepaticglycogen(HG)andmuscleglycogen(MG)levelsweresignificantlyincreased(p<0.05).Conclusion:CPhadstrongantioxidantandantifatigueeffect.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷)，期】2018(039)009【总页数】6页(P1-5,10)【关键词】菊苣多糖;抗氧化活性;抗疲劳作用【作者】付爱叶;王俏娜;吴雨龙;周峰;汪振炯;王仁雷；华春【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院,江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171;江苏省高校〃特殊生物质废弃物资源化利用”重点建设实验室，江苏南京211171;南京晓庄学院食品科学学院江苏南京211171【正文语种】中文【中图分类】TS201.1现代社会快节奏的生活方式及高强度的工作压力使得人们长期处于疲劳状态。疲劳被定义为有机体的生理过程不能使其机能继续在一特定水平工作或各器官不能再保持稳定的工作能力。当长期处于疲劳状态时,机体内氧化还原平衡被打破，过量产生自由基导致机体组织的损伤，从而引起各种机能下降,严重时还会诱发免疫、血液、风湿、心脏、肾脏、内分泌等疾病［1-4］。迄今为止，临床上常用的具有较好抗氧化作用且能够有效缓减疲劳的药物尚不能满足人们的需求。因此，寻求具有较好的抗氧化作用能力、能够提高运动、延缓疲劳以及加速人体疲劳消除的无毒副作用的天然的活性成分的研究越来越受到人们重视［5］。目前，植物多糖被认为是一种新的天然的抗氧化、抗疲劳活性物质。李晶等［6］研究表明姬松茸多糖能延长小鼠常压耐缺氧时间和负重游泳时间，提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，同时能显著提高小鼠脾脏和胸腺指数从而达到抗疲劳和增强免疫的作用。王维［7］指出,黄蘑多糖可延长小鼠负重力竭游泳时间，降低机体运动后血乳酸的积累，增加肝糖原含量而提高机体运动能力,同时提高小鼠血液中SOD活性，因而具有较好的抗疲劳和抗氧自由基作用。Zhao等［8］发现玉米须多糖可以显著延长力竭小鼠游泳时间，降低血尿素氮、乳酸水平，提高乳酸脱氢酶活性,由此体现抗疲劳作用°Jing等［9］从玛咖中提取的两种玛咖多糖组分(MPS-1和MPS-2)均具有较好的抗疲劳活性，其中MPS-2的抗疲劳活性优于MPS-1。菊苣(CichoriumintybusL.)是菊科菊苣属多年生药食两用草本植物，在我国的北京、黑龙江、福建、山西等省市分布广泛［10］。在国外，菊苣地上部分常被用作色拉和牧草以及作为生产果糖和香料的原料，而菊苣根被用来制作口香糖［11-12］。在我国，菊苣除了作为蔬菜、牧草和饲料添加剂外，还常作为药材用于治疗湿热黄疸、胃痛食少、水肿尿少等症，是维吾尔族和蒙古族常用药材［13-14］。菊苣富含多糖、或类、鞣质、萜类等多种功能活性物质［15-16］,而菊苣多糖(CP)具有多种药理作用，如降血糖［17］、降血脂［18］、抗肿瘤［19］、保肝［20］、延缓衰老［21］、降血压、利尿［22］等，但有关菊苣多糖抗疲劳作用的研究尚未见报道。本研究采用体外抗氧化实验和耐力实验评价菊苣多糖抗氧化和抗疲劳作用，以期为菊苣资源的合理开发利用提供科学理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器菊苣根湖北黄石；ICR雄性小鼠动物合格证号:SCXK(苏)2017-0004,体质量18~22g,扬州大学比较医学中心;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH自由基)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、甲硫氨酸、核黄素上海阿拉丁生化科技股份有限公司;铁氰化钾(K3［Fe(CN)6］)、三氯乙酸(TCA)、VC、三氯化铁(FeCl3)国药集团化学试剂有限公司血尿素氮(BUN)试剂盒、血清乳酸(BSLA)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、肝糖原(HG)和肌糖原(MG)试剂盒南京建成生物工程研究所;其它试剂均为国产分析纯。T6型紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;IEC1010-1型台式冷冻干燥机美国Labconco公司;SILFA型酶标仪美国BioTek公司。1.2实验方法CP的制备参照许芳等［23］报道方法并加以改进。菊苣经烘干后粉碎，过60目筛后除脂，称取一定量的菊苣粉末加入蒸馏水，经超声波酶法处理后,离心取上清，醇沉后离心取沉淀，沉淀溶于水后,经纤维素柱和葡聚糖柱洗脱，收集洗脱曲线同一峰洗脱液，经浓缩、冷冻干燥得CP。CP对羟自由基的清除作用分别取2mL不同浓度的CP溶液(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mg/mL)于试管中，然后各管分别加入2mL的硫酸亚铁(9mmol/L)和2mL水杨酸(9mmol/L),摇匀后各管加入2mL的H2O2(20mmol/L)混匀,37°C水浴30min,以蒸馏水为空白对照，以VC为阳性对照，在510nm波长下测定各反应溶液的吸光度并计算清除率［24］。实验重复三次。清除率式中,A1为蒸馏水的吸光度值;A2为待测样品的吸光度值。CP对超氧阴离子自由基的清除作用在试管中分别加入0.3mL不同浓度的CP溶液,再分别依次加入0.5mL磷酸缓冲液(pH7.8),1.5mL甲硫氨酸(0.026mol/L),0.3mLNBT(0.078mol/L),0.3mL核黄素(0.02mmol/L),混匀，将反应体系置于日光下照射30min后，以蒸馏水作空白，以VC为阳性对照,在波长560nm处测定各反应溶液的吸光度,清除率按1.2.2公式计算［25］。实验重复三次。CP对DPPH自由基清除率的测定参照Wang等［26］对DPPH自由基清除活性的方法稍作改进。在试管中分别加入2mL不同浓度的CP溶液，再分别加入2mL的DPPH自由基乙醇溶液(0.2mmol/L),在涡旋振荡器上摇匀，室温下静置避光反应30min,以无水乙醇为阴性对照，以VC为阳性对照，测定517nm处吸光度，按下式计算清除率。实验重复三次。清除率式中,A1为待测样品与DPPH自由基混合液的吸光度值;A2为待测样品与无水乙醇混合液的吸光度值;A3为DPPH自由基与无水乙醇混合液的吸光度值。CP还原力的测定分别在试管中加入1mL不同浓度的CP溶液中,依次加入mL的PBS(0.2mol/L,pH6.6)和2.5mL铁氰化钾(1%,W/V),混匀后在50°C水浴锅中孵育20min,立即加入2.5mL的TCA(10%,W/V)终止反应，离心(3000r/min,10min)。取上清液2mL于试管中，依次加入2mL无水乙醇和0.25mL(0.1%,W/V)的FeCl3溶液，混匀后测定700nm处吸光度。以蒸馏水为阴性对照，以VC为阳性对照［27］。实验重复三次。1.2.6CP抗疲劳作用研究实验设计根据Li等［9］关于抗疲劳测定方法稍作改进。60只ICR雄性小鼠适应性饲养5d后，随机分为4组(15只/组):空白对照组(蒸馏水)、CP低剂量组(50mg/kg)、CP中剂量组(100mg/kg)和CP高剂量组(200mg/kg)。每天上午9点按对应剂量对各组小鼠进行灌胃，连续灌胃30d。小鼠负重游泳实验第30d时,对各组小鼠进行称重，淘汰各组中与平均体重差距较大的小鼠，每组保留10只体重相近的小鼠。对各组小鼠进行灌胃,30min后,进行负重游泳实验。在各组小鼠尾巴上系上体质量7%的铅丝，置于游泳箱内(水深35cm,水温(25±1)°C)游泳，以小鼠头部没入水中7s不能浮出水面为体力耗尽,记录力竭时间。生化指标的分析各组小鼠力竭游泳实验后，从游泳箱中捞出、擦干，放回鼠笼休息,60min后，各组小鼠眼眶采血后颈椎脱臼法处死，取肝脏和大腿肌肉组织。用试剂盒测定BUN、BSLA、MDA、SOD、HG和MG。1.2.7统计学分析所有实验数据以平均值士标准差表示，采用SPSS19.0软件进行分析，统计学分析采用单因素方差分析法及t检验法分析各组之间的差异,p<0.05为显著性标准，采用Graphpadprism6作图分析结果。2结果与分析CP对羟自由基的清除率羟基自由基是活性氧自由基中毒性最大的自由基，如果人体内有过多的羟基自由基会影响细胞膜而产生过氧化氢和活性氧,进而导致诸如易疲劳、动脉硬化、老化、突变等症状,对人体的健康造成严重危害［28］。由图1可知在0.1~2.4mg/mL范围内,CP表现出明显的羟自由基清除活性，其羟自由基的清除能力随添加浓度的升高而逐渐增强。当浓度为2.4mg/mL时CP对羟自由基清除率达40.93%,但CP的羟自由基清除能力显著(p<0.05)低于同浓度的VC。图1CP对羟自由基的清除作用Fig.1ScavengingeffectofCPagainsthydroxylfreeradicalsCP对超氧阴离子自由基的清除率超氧阴离子自由基是人体代谢过程中产生的未配对电子的原子团，虽然其氧化性与其他氧自由基相比较弱，但它在代谢过程中会分解成氧化性很强的单线态氧自由基或羟自由基，从而造成细胞组织损伤或生物大分子结构的变化，使人体产生疲劳［24］。从图2可知在0.1~2.4mg/mL范围内,CP表现出明显的超氧阴离子自由基清除活性，且随着CP浓度的升高，对超氧阴离子自由基的清除力逐渐增强。当CP浓度在2.4mg/mL时，超氧阴离子自由基清除率达67.11%,但CP的超氧阴离子自由基清除能力低于同浓度的VC。图2CP对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2ScavengingeffectofCPagainstsuperoxideanionCP对DPPH自由基的清除作用根据图3可知,CP对DPPH的清除率随CP浓度的增加而升高。当浓度为2.4mg/mL时CP对DPPH自由基的清除率达到58.17%,但低于同浓度的VC。图3CP对DPPH自由基的清除作用Fig.3ScavengingeffectofCPagainstDPPHfreeradicalsCP的还原力抗氧化活性的机制主要包括还原力机制，链引发的抑制机制，过渡金属离子催化剂的折叠机制，过氧化物的分解和自由基清除机理。因此，一种化合物的还原能力可以作为具有潜在抗氧化活性的一个重要指标［12］。通过图4可知，随着CP浓度的升高，总的还原力也越来越强，在CP浓度为2.4mg/mL时,CP还原力达到最大（吸光度为0.453）。何年武等［27］在测定黄瓜多糖还原力时发现，当黄瓜多糖浓度为4mg/mL时其在700nm处的吸光度为0.350,而本研究中CP在浓度为2.4mg/mL时其吸光度为0.453,还原力高于黄瓜多糖，由此说明CP具有较好的还原能力。图4CP的还原力Fig.4ReducingpowerofCPCP的抗疲劳功效CP对小鼠负重游泳时间的影响游泳时间的长短可以体现运动耐力的强弱可以反映抗疲劳的程度［29］。由图5可知，与空白组小鼠相比,CP各剂量组小鼠均延长了负重游泳时间,且随着给药剂量的增加小鼠负重游泳的时间也显著增加。表明CP具有较好的抗疲劳功效。图5CP对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.5InfluencesofCPonexhaustiveswimmingtimeofmice.注:与空白组比较,*差异显著(p<0.05)，**差异极显著(p<0.01)；图6~图7同。CP对小鼠血清生化指标的影响作为机体中蛋白质和氨基酸的代谢产物,BSLA是一种无氧条件下糖酵解的产物，两者均是评价疲劳的重要参数之一［9］。当机体能量缺乏时，蛋白被消耗，同时BUN水平升高，导致运动性疲劳增加［30］。由图6-A和图6-B可知，与空白组相比,CP各剂量组小鼠血清BUN和BSLA水平均显著降低(p<0.05,p<0.01)。在生物体内,自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化的最重要的终产物之一为MDA,其会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性［3］。图6CP对小鼠血清BUN、BSLA、MDA和SOD的影响Fig.6InfluencesofCPonBUN,BSLA,MDA,andSODinserumofmice图6-C表明,CP能够降低机体中MDA的含量，且CP中剂量及高剂量组与空白组相比能显著降低机体中MDA的含量(p<0.05),提示CP能够降低自由基氧化过程，具有较好的抗疲劳作用。SOD是体内重要的抗氧化酶，能够有效清除体内超氧阴离子自由基，对提高运动能力,减轻疲劳和损伤具有重要意义［31］。如图6-D所示，与空白组相比,CP能够提高机体内SOD的活性，尤其是中(p<0.05)、高剂量组(p<0.01)能够显著提高SOD的活性。结果表明,CP能够提高机体SOD活性来清除自由基，能有效抵抗脂质过氧化损伤，缓减疲劳。CP对小鼠肌糖原和肝糖原的影响研究表明，肌糖原、肝糖原等储能物质的耗竭是产生疲劳的重要原因之一［32］。机体在初始运动时首先消耗的是肌糖原，随着肌糖原消耗殆尽，机体则动用肝糖原以维持血糖水平［33］。由图7可知，与空白组相比CP各剂量组均能够明显提高机体中肝糖原和肌糖原的含量。以上结果表明,CP可能通过增加机体肌糖原和肝糖原的储备等途径发挥抗疲劳作用。图7CP对小鼠肝糖原和肌糖原的影响Fig.7EffectsofCPonHGandMGinmice3结论体外抗氧化实验结果表明,CP能够较好的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基，且具有较强的还原能力;抗疲劳实验结果表明,CP能明显延长小白鼠负重游泳时间，显著降低负重游泳后血清中BUN、BSLA和MDA的含量，明显提高了血清SOD活性以及肌糖原和肝糖原的储备量，表明CP具有较好的抗氧化和抗疲劳作用。当然，有关CP对抗氧化和抗疲劳作用的机制有待进一步深入研究,为发挥菊苣的资源优势，利用CP开发保健食品和治疗药物等深加工产品提供理论基础。参考文献【相关文献】HuangWC,ChiuWC,ChuangHL,etal.Effectofcurcuminsupplementationonphysiologicalfatigueandphysicalperformanceinmice[J].Nutrients,2015,7(2):905-921.YouL,RenJ,YangB,etal.Anti-fatigueactivitiesofloachproteinhydrolysateswithdifferentantioxidantactivities[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2012,60(50):12324-12331.王维，刘聪，蒋岩，等.复方五味子提取物的抗疲劳作用及其机制[J].吉林大学学报:医学版2017,43(3):502-506.NiW,GaoT,WangH,etal.Anti-fatigueactivityofpolysaccharidesfromthefruitsoffourTibetanplateauindigenousmedicinalplants[J].JournalofEthnopharmacology,2013,150(2):529-35.UthayathasS,KaruppagounderSS,TamerSB,etal.Evaluationofneuroprotectiveandanti-fatigueeffectsofsildenafil[J].LifeSciences,2007,81:988-992.李晶，魏健.姬松茸多糖增强免疫功能及抗疲劳作用的研究[J].食品研究与开发,2017,38(5):201-204.王维.黄蘑多糖抗疲劳及抗氧自由基水平的机制[J].中国老年学杂志,2017,37(7):1620-1621.ZhaoHP,ZhangY,LiuZ,etal.Acutetoxicityandanti-fatigueactivityofpolysaccharide-richextractfromcornsilk[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2017,90:686.JingL,SunQ,MengQ,etal.Anti-fatigueactivityofpolysaccharidefractionsfromLepidiummeyenii,Walp.(maca)[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2017,95:1305-1311.中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第80(1)卷)[M].北京:科学出版社,1997:8.DalarA,KonczakI.CichoriumintybusfromEasternAnatolia:Phenoliccompositionantioxidantandenzymeinhibitoryactivities[J].IndustrialCropsandProducts,2014,60:79-85.SahanY,GurbuzO,GuldasM,etal.Phenolics,antioxidantcapacityandbioaccessibilityofchicoryvarieties(Cichoriumspp.)growninTurkey.[J].FoodChemistry,2017,217:483.庄红艳涨冰，刘小青，等.菊苣药材中菊苣多糖的含量测定研究[J].中成药,2011,33(1):114-117.胡超，白史且,游明鸿，等.菊苣多糖的研究进展[J].草业与畜牧,2013(2):44-48.Sanchez-SaenzCM,deOliveiraRA,ParkKJ.EvaluationofchicoryrootssubmittedtoHTSTdryingprocessanditsoptimization[J].JournalofFoodProcessEngineering,2015,38(1):57-66.GrazianiG,FerracaneR,SamboP,etal.Profilingchicorysesquiterpenelactonesbyhighresolutionmassspectrometry[J].FoodResearchInternational,2015,67(1):193-198.JacksonKG,TaylorGR,ClohessyAM,etal.Theeffectofthedailyintakeofinulinonfastinglipid,insulinandglucoseconcentrationsinmiddle-agedmenandwomen[J].TheBritishJournalofNutrition,1999,82(1):23-30.KimM,KKShin.Thewater-solubleextractofchicoryinfluencesserumandliverlipidconcentrations,cecalshort-chainfattyacidconcentrationsandfecallipidexcretioninrats[J].JournalofNutrition,1998,128:1731-1736.陈立阁倡友权，郑鸿雁，等.奇可力多糖抗肿瘤作用的实验研究[J].食品科学,2004,25(11):276-280.FarhangiMA,JavidAZ,DehghanP.Theeffectofenrichedchicoryinulinonliverenzymes,calciumhomeostasisandhematologicalparametersinpatientswithtype2diabetesmellitus:Arandomizedplacebo-controlledtrial[J].PrimaryCareDiabetes,2016,10(4):265-271.LinWQ,LiuCQ,YangH,etal.Chicory(CichoriumintybusL.)Chicory,atypicalvegetableinMediterraneandiet,exertsatherapeuticroleinestablishedatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmice[J].MolecularNutrition&FoodResearch,2015,59(9):1803-1813.罗惠善.人工栽培菊苣水提取物的降压、利尿作用的研究[J].中国实用医药,2010,5(29):124-125.许芳，吴雨龙,王俏娜，等.超声波协同酶法提取菊苣根多糖工艺优化[J].食品工业科技2017,38(9):168-173,180.马虎飞，王思敏,杨章民.陕北野生枸杞多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学