RNA干扰技术-生物化学与分子生物学课件

RNA干扰技术董莹董翠玲陈崇波

1RNA干扰技术董莹董翠玲陈崇波12006年诺贝尔生理学或医学奖：美国斯坦福大学AndrewZ．Fire美国马萨诸塞大学CraigC．Mello，以表彰他们发现了RNAi现象22006年诺贝尔生理学或医学奖：2什么是RNAi？一、RNAi的发现二、RNAi的分子机制三、RNAi的生物学功能与意义四、RNAi试验方法3什么是RNAi？一、RNAi的发现3一、RNAi的发现4一、RNAi的发现4WTPlantwithapigmenttransgenePostTranscriptionalGeneSilencinginPetuniaRNAi的发现5WTPlantwithapigmenttransge1995年，GuoS等试图阻断秀丽线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达设计：反义RNA特异性地阻断par-1基因的表达正义RNA以期观察到基因表达的增强结果:二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释61995年，GuoS等试图阻断秀丽线虫（C.elegans直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（简称RNAi）。7直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这RNAi概念

RNA干扰(RNAi)是指dsRNA在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。8RNAi概念RNA干扰(RNAi)是指dRNAi

特点转录后水平的基因沉默机制较高的特异性抑制基因表达具有较高的效率有浓度、时间双重依赖性基因表达的效应可以突破细胞界限9RNAi特点转录后水平的基因沉默机制9二、RNAi的分子机制1.起始阶段(theinitiationphase)2.效应阶段(thesubsequenteffectorphase)1010dsRNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链RNA内切酶Dicer识别dsRNA，在ATP的参与下逐步把dsRNA切割成长约21～23nt的片段。Dicer11dsRNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，ATP激活的RISC在双链siRNA的反义链指导下，寻找与siRNA具有同源序列的内源靶mRNA，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割靶mRNA，导致转录后基因沉默。12siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)1313三、RNAi的生物学功能与意义14三、RNAi的生物学功能与意义14RNAi的生物学功能抵抗病毒入侵抑制转座子活动，保护基因组的完整性调控基因表达清除畸变的RNA参与基因组重排15RNAi的生物学功能抵抗病毒入侵15RNAi的生物学意义1.研究功能基因组学的新工具2.研究信号传导通路的新途径3.研究发育过程中起作用的基因4.开展基因治疗的新策略16RNAi的生物学意义1.研究功能基因组学的新工具16四、RNAi试验方法17四、RNAi试验方法171.筛选RNAi探针2.制备siRNA

化学合成、体外转录、用RNaseⅢ消化长片断双链RNA、siRNA表达载体、siRNA表达框架3.导入细胞

电穿孔法、磷酸钙共沉淀、DEAE一葡聚糖、阳离子脂质体试剂4.RNAi转染效率荧光蛋白(如GFP)或荧光素酶等报告基因与其共表达法181.筛选RNAi探针181919Abstract：Invitro,RNAiisanalmost-standardmethodtoknockdownanytargetgene.Invivo,itseffcientdeliveryandspecificitytothetargetgenechallengeitstherapeuticapplication.Now,manyeffortshavemadetoenhancesiRNAdeliveryandtargetorganspecificity.20Abstract：Invitro,RNAiisInvitroseveraltransfectionreagentsallowthedeliveryofsiRNAsinmammaliancellsinthepresenceorabsenceofserumIn

vivorequirethedevelopmentofmoresophisticatedformulationsand/ortheidentificationofoptimalmodesofadministration21InvitroseveraltransfectTherapeuticsiRNAmolecules

Cancer:Targetmoleculesusuallyrepresentgenesthathavebeenshownpreviouslytoberelevantorrate-limitingfortumorgrowthAntiviraltreatment

:novelRNAi-basedapproachestobattleviralinfectionsrelyonthespecificsiRNA-mediatedknockdownofvirus-specificgenes22TherapeuticsiRNAmolecules

CaThisstudiesprovidevaluableinsightsintothedeliveryandefficacyoffortheinductionofRNAi.23ThisstudiesprovidevaluabClinicaltrials

ALN-RSV01:targetthehumanRSVafterviralinfection,whichisthefirstexampleofanantivirussiRNA-basedtherapeuticinaphaseⅠclinicalstudy.

Sirna-027:TotreatAMD,

after24-monthphaseIIstudy,IthasalreadyusedforrecruitingpatientswithAMD.Cand5:whichisnownamedBevasiranib,wasthefirstsiRNAtoenterbothphaseIandIIclinicaltrials.24Clinicaltrials

ALN-RSV01:tarStrategiesforinvivosiRNAdelivery

TheadvantagesofthedirectapplicationofsiRNAs:thelowerprobabilityonspecificsideeffectsthesafetyofsiRNAdeliveryisbasedonnonviraltransferstrategiessiRNAscannotintegrateintothegenome25StrategiesforinvivosiRNAd

SuccessfulsiRNAbasedgenetargetingreliesonseveralpreconditions:

ProtecttheinstablesiRNAmoleculesEfficientcellularuptakeandintracellularreleaseintothecytoplasmTheabsenceofintracellularimmuneresponses26

SuccessfulsiRNAbasedgenetTheformulationofsiRNAsincarriersystems：LiposomalformulationsNanoparticlespolyethylenimine(PEI)ItcanbeconsideredasexamplesofnonviralenvelopesthatprotectsiRNAs,thusincreasingserumstability,reducingrenalexcretionandmediatingsiRNAuptakeintothecellsthroughendocytosisnanoparticleswithpositivelychargedmacromolecules.Basedonelectrostaticinteractions,complexesareformedwithatelocollagenchitosanorPEIPEI/siRNAcomplexesaregoodforenhancingtissuespecificityandinvivobiocompatibility,reducingimmunogenicityandtoxicityandincreasingsiRNAdelivery27Itcanbeconsideredasexampl2828ConclusionandoutlookAveryefficientandspecificmethodfortheknockdownThesuccessofsiRNAswilldependontheirefficie