第4章蛋白质的化学

第4章蛋白质的化学第一页，共87页。预习重点：1.蛋白质的功能2.氨基酸组成、分类、两性解离3.氨基酸的分离分析4.蛋白质的一级结构、肽键和肽链5.维持蛋白质构象的化学键6.蛋白质的二级结构7.蛋白质的结构与功能学习难点：1.谷胱甘肽2.蛋白质一级结构的测定3.基序、三级结构、四级结构4.蛋白质合成基本原理5.蛋白质的性质6.蛋白质分离纯化7.蛋白质纯度鉴定第一页第二页，共87页。第一节蛋白质是生命的物质基础第二页第三页，共87页。一、蛋白质是构成生物体的基本成分第三页第四页，共87页。二、蛋白质具有多样性的生物学功能生物催化作用（酶）代谢调节作用（激素）免疫保护作用（抗体）转运和贮存作用（血红蛋白)运动与支持作用（肌动蛋白、胶原蛋白）控制生长和分化作用（核蛋白）接受和传递信息作用（受体蛋白）生物膜的功能第四页第五页，共87页。第五页第六页，共87页。第二节蛋白质的化学组成第六页第七页，共87页。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。100克样品中蛋白质的含量(g%)====每克样品含氮克数×6.25×100

凯氏定氮法测定蛋白质含量:定氮仪一.蛋白质的元素组成：第七页第八页，共87页。二、蛋白质结构的基本单位──氨基酸组成蛋白质的氨基酸共有20种，称为基本氨基酸。（一）基本氨基酸的结构通式CαHCOOHRH2N不同的α-氨基酸，其R侧链不同除甘氨酸、脯氨酸外，基本氨基酸皆为L-α-氨基酸。第八页第九页，共87页。20种氨基酸的分类：根据R基不同，分为4类甘氨酸glycineGlyG5.97丙氨酸alanineAlaA6.00缬氨酸valineValV5.96亮氨酸leucineLeuL5.98异亮氨酸isoleucineIleI6.02苯丙氨酸phenylalaninePheP5.48脯氨酸prolineProP6.301、非极性疏水性氨基酸2第九页第十页，共87页。色氨酸tryptophanTryW5.89丝氨酸serineSerS5.68酪氨酸tyrosineTryY5.66半胱氨酸cysteineCysC5.07蛋氨酸methionineMetM5.74天冬酰胺asparagineAsnN5.41谷氨酰胺glutamineGlnQ5.65苏氨酸threonineThrT5.602、极性中性氨基酸第十页第十一页，共87页。天冬氨酸asparticacidAspD2.97谷氨酸glutamicacidGluE3.22赖氨酸lysineLysK9.74精氨酸arginineArgR10.76组氨酸histidineHisH7.593、酸性氨基酸4、碱性氨基酸第十一页第十二页，共87页。（三）、氨基酸的化学性质

①两性解离与等电点②紫外吸收性质③茚三酮反应第十二页第十三页，共87页。①.两性解离氨基酸在水溶液和晶体状态主要以兼性离子形式存在CHRCOO－H3N+第十三页第十四页，共87页。等电点的定义：当溶液处于某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。每种氨基酸都有特定的等电点。在等电点时，氨基酸的溶解度最小。等电点第十四页第十五页，共87页。COO－CHH3N+R+OH－+H+COO－CHH2NR+OH－+H+在酸性溶液中（pH＜pI）在水溶液中（pH=pI）在碱性溶液中（pH＞pI）COOHCHH2NR溶液pH影响氨基酸的羧基与氨基的解离程度第十五页第十六页，共87页。COO－CHH3N+CH3

K1COOHCHH3N+CH3COO－H2NCH3K2Ala+Ala±Ala－HCCOOHCHH3N+CH2COOHCOO－CHH3N+CH2COOHCOO－CHH2NCH2COO－Asp+Asp±Asp－Asp=K1K2K3CCCH2COON+3HOO－H举例：－第十六页第十七页，共87页。②.紫外吸收在紫外区酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸光能力。苯丙氨酸的max＝259nm酪氨酸的max＝278nm色氨酸的max＝279nm蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，所以也有紫外吸收能力。一般用紫外分光光度计在280nm波长下测定最大光吸收，而测定蛋白质的含量。第十七页第十八页，共87页。

③.茚三酮的反应A.该反应非常灵敏，测定范围：0.5~50µg/mlB.氨基酸与茚三酮，生成的蓝紫色化合物，在570nm测定吸光值C.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm处测吸光值应用：A.氨基酸定量分析（纸层析法或者薄膜层析法分离）B.氨基酸自动分析仪第十八页第十九页，共87页。氨基酸的分离与分析自动氨基酸分析仪1.蛋白质完全酸水解2.水解液于PH2上样于钠型阳离子交换柱3.用PH3.50.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱4.用PH4.250.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱5.分析洗脱谱上各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析P66★第十九页第二十页，共87页。第三节蛋白质的分子结构第二十页第二十一页，共87页。一级结构（决定空间结构）：又叫共价结构或基本结构，指蛋白质中不同氨基酸的种类、数量和排列顺序。（构象）空间结构二级结构三级结构四级结构基序结构域（决定功能）第二十一页第二十二页，共87页。+-HOHNH2-CH-C-N-CH-COOHR2HR1ONH2-CH-CR1OOH

NH-CH-CR2OOHH肽键由一分子氨基酸的α羧基和另一分子氨基酸α氨基缩合脱水而成。概念：肽、二肽、寡肽、多肽、多肽链第二十二页第二十三页，共87页。H2NCNCCOOHRnHHCOR3NHCHCCR1HOOR2NHCHR4NHCHCON-末端C-末端氨基酸残基氨基酸残基:多肽链中的氨基酸参与肽链的形成，已非原来完整的分子，称为氨基酸残基。共价主链：多肽链中的骨干是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽链部分规则的重复排列而成，称为共价主链。侧链：多肽链中R基部分，称为侧链。第二十三页第二十四页，共87页。方向性：书写方式：N端写在左边，C端写在右边命名：从N端到C端CNN末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端H2NCH2COOHCNHCCCH3OOOHNCH2CHH丙氨酸丝氨酸甘氨酸第二十四页第二十五页，共87页。一级结构中化学键：肽键（主要）、二硫键（少量）二硫键：由两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢而成，存在于肽链内或肽链间

牛核糖核酸酶C末端N末端第二十五页第二十六页，共87页。GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+生物活性肽1.谷胱甘肽(GSH)第二十六页第二十七页，共87页。体内许多激素属寡肽或多肽2.多肽类激素第二十七页第二十八页，共87页。二.蛋白质的一级结构测定1.氨基酸组成的分析⑴蛋白质样品的纯化⑵蛋白质分子中多肽链数目的测定

⑶氨基酸组成的分析：①氨基酸自动分析仪②含多个亚基的蛋白质，先纯化为单个亚基，再测定每个亚基氨基酸组成

①分析肽链的N-末端氨基酸②分析肽链的C-末端氨基酸第二十八页第二十九页，共87页。N末端氨基酸分析A.二硝基氟苯（DNFB）法：P70B.二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）灵敏度：1

10-9mol。C.Edman法（苯异硫氰酸，PITC法）：P71，蛋白质自动分析仪D.氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解氨基酸。第二十九页第三十页，共87页。A.肼解法:C末端氨基酸分析B.羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的C-端逐个水解氨基酸。第三十页第三十一页，共87页。大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解A.化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺NH2OH裂解法

B.酶裂法:胰蛋白酶，胃蛋白酶等第三十一页第三十二页，共87页。确定肽段在多肽链中的次序：重叠法P72

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

16肽，Ｎ端H

Ｃ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT

Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO

重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS⑤第三十二页第三十三页，共87页。核糖体蛋白质链5.核酸推导法第三十三页第三十四页，共87页。二、蛋白质的构象蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布、及肽链走向。又称为空间结构、立体结构、高级结构和三维构象等。蛋白质的分子构象包括：蛋白质的二级结构、三级结构、四级结构（一）维持蛋白质构象的化学键氢键、疏水键、盐键、配位键、二硫键、范德华力第三十四页第三十五页，共87页。SSNHOoCCSSOHOCH2NH3+COO-疏水键二硫键盐键侧链氢键氢键1.氢键:由连接在一个电负性大的原子上的氢与另一电负性大的原子相互作用形成；多肽链主链骨架上羰基氧原子与亚氨基的氢原子间形成氢键维持二级结构的主要次级键；侧链间或主链间所生成的氢键是维持三、四级结构的主要化学键之一。2.疏水键:两个非极性基团因避开水相而聚集在一起的作用力，维持蛋白质三、四级结构的主要次级键。第三十五页第三十六页，共87页。盐键：蛋白质分子中带正电荷集团和负电荷基团之间静电吸引所形成的化学键。第三十六页第三十七页，共87页。（二）蛋白质的二级结构多肽主链原子的局部空间排列。即多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要次级键形成有规则的构象。肽单位：肽键与相邻的两个α碳原子所组成的基团，又称肽平面。CαCNCαOH第三十七页第三十八页，共87页。肽键具有部分双键性质，不能自由旋转；肽单位是刚性平面结构，肽单位的6个原子都位于同一平面上；肽单位的特点：第三十八页第三十九页，共87页。α-螺旋结构β-折叠结构

β-折角蛋白质二级结构构象的种类：第三十九页第四十页，共87页。α角蛋白中的α-螺旋和二硫键第四十页第四十一页，共87页。（三）基序多肽内顺序上相邻的二级结构在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。超二级结构的基本形式：α螺旋组合（αα）β折叠组合（βββ）α螺旋β折叠组合（βαβ）第四十一页第四十二页，共87页。（四）结构域在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密的三维实体。免疫球蛋白G的立体结构第四十二页第四十三页，共87页。（五）蛋白质的三级结构一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布。主要化学键：疏水键、氢键、盐键第四十三页第四十四页，共87页。（五）蛋白质的四级结构由两个或两个以上的多肽链之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构。每一条多肽链都有完整的三级结构，这每条多肽链称为蛋白质的一个亚基。主要化学键：疏水键、氢键、范德华力、盐键、二硫键第四十四页第四十五页，共87页。血红蛋白的一、二、三、四级结构第四十五页第四十六页，共87页。（一）肽的人工合成

保护（氨基、羧基、侧链活性基团）

活化（氨基、羧基）

缩合剂

（二）胰岛素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成第四十六页第四十七页，共87页。第四十七页第四十八页，共87页。

第四节蛋白质的结构与功能第四十八页第四十九页，共87页。蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的物质基础。蛋白质分子特定的天然构象是蛋白质生物功能的体现。第四十九页第五十页，共87页。一、蛋白质一级结构与功能的关系一级结构不同，生物学功能各异加压素H2N-半胱–酪-苯丙-谷胺–天胺–半胱-脯-精-甘-CO-NH2缩宫素H2N-半胱–酪-亮-谷胺–天胺–半胱-脯-异亮-甘-CO-NH2第五十页第五十一页，共87页。一级结构中关健部分相同，其功能相同ACTHACTH活性必需部分-丝-酪-丝24丝--谷苯丙-COO-H3N+12324313339-丝-酪-丝24亮--谷苯丙-COO-H3N+-丝-酪-丝24丝--谷胺苯丙-COO-

H3N+人猪牛第五十一页第五十二页，共87页。一级结构关键部分的变化，其生物活性也改变多肽或蛋白质氨基酸位置相对活性脑啡肽（5肽）衍生物甘2蛋5D-丙蛋-CO-NH2110P84第五十二页第五十三页，共87页。一级结构的变化与疾病的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

这种由遗传物质DNA突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为“分子病”。第五十三页第五十四页，共87页。镰刀形红细胞正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图正常红细胞第五十四页第五十五页，共87页。二、蛋白质的空间构象与功能的关系1.蛋白质前体活化

P852.蛋白质变构3.蛋白质构象改变与疾病第五十五页第五十六页，共87页。当配体与亚基（蛋白）结合后，引起该亚基构象变化，称为变构效应。2、蛋白质变构效应第五十六页第五十七页，共87页。3.蛋白质构象改变与疾病因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病。疯牛病是由朊病毒蛋白(PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠

正常

疯牛病第五十七页第五十八页，共87页。不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物

AA差异数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

三、蛋白质的结构与生物进化第五十八页第五十九页，共87页。第五节蛋白质的性质第五十九页第六十页，共87页。一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定分子量＞10000蛋白质；＜10000多肽

P87胰岛素分子量为5437，习惯上称为蛋白质形状：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆形、纤维状分子量测定常用方法：①分子筛层析法②SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS）③生物质谱第六十页第六十一页，共87页。①.分子筛层析法测定蛋白质分子量大小凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0第六十一页第六十二页，共87页。②.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量大小第六十二页第六十三页，共87页。3.生物质谱（MS）测定蛋白质分子量大小第六十三页第六十四页，共87页。二、蛋白质的变性

某些理化因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变的现象。

变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构第六十四页第六十五页，共87页。变性作用的因素物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈振荡等化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等变性作用的意义变性的特征：生物活性的丧失某些理化因素的改变溶解度降低，易沉淀不对称性增加粘度增加扩散系数降低分子结构松散，易被水解第六十五页第六十六页，共87页。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性第六十六页第六十七页，共87页。三、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点（pI）

在某一pH的溶液中，蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。第六十七页第六十八页，共87页。CHNH2COOHRpH=pI+OH-pH>pI+H+NH3+COO-CHNH2COO-R+OH-+H+pH<pICHCOOHRNH3+蛋白质的兼性离子阳离子阴离子RCH第六十八页第六十九页，共87页。四.蛋白质的胶体性质+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质水化膜水化膜蛋白质形成亲水胶体的因素：①蛋白质表面有水化层②蛋白质表面具有同种电荷第六十九页第七十页，共87页。五、蛋白质的沉淀反应蛋白质分子从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。1.中性盐沉淀：硫酸铵、氯化钠2.有机溶剂沉淀反应：乙醇、苯酚3.加热沉淀反应：4.重金属盐沉淀反应：重金属中毒5.生物碱试剂：药检（三氯醋酸）第七十页第七十一页，共87页。六、蛋白质的颜色反应P931.茚三酮反应：氨基2.双缩脲反应：肽键3.酚试剂反应：酪氨酸、色氨酸第七十一页第七十二页，共87页。七、蛋白质的免疫学性质1.抗原，抗原性2.抗体

单克隆抗体

多克隆抗体3.蛋白质免疫性质的应用

免疫预防：疫苗免疫、诊断治疗第七十二页第七十三页，共87页。二、蛋白质的分离与纯化利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用不同的纯化方法第七十三页第七十四页，共87页。（一）利用溶解度不同的分离纯化方法

1.等电点沉淀2.盐析沉淀3.低温有机溶剂沉淀法4.温度对蛋白质溶解度的影响0-40℃之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，40-50℃以上开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在0℃或更低的温度下进行。第七十四页第七十五页，共87页。超过滤加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器

透析（二）根据分子大小不同的分离纯化方法1.透析和超过滤2.凝胶过滤3.密度梯度离心第七十五页第七十六页，共87页。2.分子排阻层析未知logMr洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）第七十六页