结核病药敏实验

结核病实验室检查方法及质量控制铜陵市疾控中心左延才主要内容痰涂片（简单法）结核菌培养结核菌药敏实验液体培养结核菌涂片镜检标准化操作涂片镜检是发现结核病传染源的最主要方式是疗效判断的重要依据技术简单、不需要特殊设备快速：2小时可报告结果最具成本/效益TB

可疑者TB

病人标本收集及保存标本接收和登记涂片染色显微镜检结果记录材料准备涂片保存用于EQA标本/污染物的安全丢弃结果报告对象结核病可疑者咳嗽、咳痰超过2周咳血或伴有血痰发热或胸痛超过2周胸部X线异常确诊并正在接受治疗的结核病人标本收集指南安全意识:患者比标本有危险!告知患者咳嗽时掩口；收集痰标本时：室外或单独的留痰室，且避开他人。只有高质量的痰才能有准确可信的抗酸菌结果

提高痰菌检出率的要素1.认识查痰的重要性2.固定痰检人员3.加强工作责任心4.较好的痰检设备5.重视留痰质量6.提高查痰技术7.使用合格的染液和耗材8.对可疑排菌者多次查痰9.加强痰检质控痰涂片镜检室间质量控制提高痰涂片的可信性和可靠性提供更可靠的支持提高痰涂片检查的敏感性室间质量评估现场评价：频率要求：国家参比室每年不定期对省级参比室进行现场评价，同时抽查市及县级实验室省级参比室对市级参比室半年进行一次，市级参比室半对县级结核病实验室每季度一次；

督导方式：

——现场督导上级实验室检验人员赴基层实验室现场指导，抽取痰片复验。

——非现场督导基层实验室将保存近期3个月的全部痰片，及实验记录，送上级实验室复验。（涂片保存量要求：弃旧存新、保存近期3个月、年涂片量不足500全部保留，近3个月超过1000张，按照弃旧存新保存近期1000张。）

室间质量评估盲法复检原则：盲法、随机实施模式：两种模式，第一种：同级实验室作为第一复检，上级实验室作为第二复检；第二种：也可由上级实验室进行第一复检，然后再由该实验室的另一实验员进行第二复检（由省参比室决定并核准采取何种方式）。室间质量评估盲法复检现场抽片方法：计算抽片量、抽样间隔、抽片、填写表5涂片号、变更涂片号、初检结果、表6涂片号。若抽样片丢失或者损坏，选择下一张涂片，并填写变更涂片号，并在备注栏说明原因，但其它编号不变，即未丢失或损坏的涂片仍按原抽取的编号进行抽片。室间质量评估盲法复检结果评价量化误差：同一张阳性涂片初检者和复检者阳性级别判断相差2个及以上。定性偏差：在盲法复检中，如果一次盲法复检中出现1个及1个以上高假阳或高假阴涂片，或者一次盲法复检中低假阳与低假阴片数达到或超过2个分枝杆菌分离培养（简单法）为什么进行培养对痰涂片阴性的病人进行诊断获得药敏试验所需的纯培养物-MDR诊断：是获得药敏试验所需纯培养物的前提和基础-疗效判断：是评价治疗效果的重要指标结核分枝杆菌的生长要求：

专性需氧菌最适生长温度为37℃

最适PH为6.5～7.2

营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子培养标本的选择诊断病例－3涂2培3份痰标本均为阳性：选取阳性级别高的2份痰标本进行培养；3份痰标本2份阳性：选取2份阳性痰标本进行培养；3份痰标本1份阳性：选取阳性标本和1份质量好的阴性标本进行培养3份痰标本均为阴性：不培养（不是符合条件的耐多药可疑者）随访病例－2涂2培无论涂片结果如何，2份随访标本均做培养分离培养的操作程序

培养基的准备标本前处理（去污染）接种孵育报告结果标本收集、储存和运输

收集：即时痰、夜间痰、晨痰保存：4℃保存运输（UN3373类包装）：3天内必须运送到实验室，7天内必须进行培养痰标本1－2倍4%

NaOH振荡匀化静置15分钟均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时37℃竖直培养8周分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长报告实际菌落数：菌落生长不足斜面面积1/4分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面报告方式分枝杆菌培养阳性药物敏感性试验

药敏试验的目的开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案耐药的产生耐药是细菌群体的一种基本的现象。对于空洞型肺结核病患者，在开放性空洞中细菌的含量可达107-109，而干酪样坏死病变中细菌含量一般不超过102-104。结核分枝杆菌存在自发的突变，每代每个细菌对以下药物的平均突变概率分别为：

INH：3×10-8，

SM：3×10-8，

EMB：1×10-7，

RMP：2×10-10，

理论上对两种药物同时耐药的突变概率为10-15。耐药的产生根据广泛认同的理论，耐药的产生是由于在治疗过程中对患者体内已存在的耐药突变菌选择和增殖的结果。在应用链霉素治疗结核病的过程中发现耐药现象的产生。如果单独给予链霉素，开始时患者的症状迅速改善，痰菌减少；但随后患者的症状恶化，痰菌增多，表现出耐药，患者的分离菌株可以在含链霉素的培养基上生长。药敏试验方法基于检测标本直接方法直接用涂阳标本进行试验优点：快速得到结果，较好地反应病变部位菌群的耐药性；缺点：容易失败，很难确定接种量/菌活性。间接方法使用培养物进行药敏试验优点：更好地控制接种量/菌活性缺点：耗时长试验方法世界卫生组织推荐的药敏试验方法基于生长观察：固体培养方法比例法绝对浓度法基于生长检测（产生二氧化碳、消耗氧气等）液体药敏法基于基因突变检测探针杂交、测序等方法

从实验室操作角度讲，比例法与绝对浓度法并无很大差别，但由于比例法是通过计算耐药菌比例来解释结果的，对药敏试验中的重要变异因素——接种量进行了一定程度的校正，故结果较之绝对浓度法更为稳定。比例法原理野生菌群的结核分枝杆菌都含有一定数量的突变菌株，所谓敏感株和突变株的不同在于总菌群中突变菌所占比例高低的不同。如果一个试验能够将这一比例计算出来，则能区分耐药和敏感株。首先要得到活菌的总数和突变菌的数目。这可以通过将适宜稀释度的菌液接种于不含药、含药的培养基上，然后计数菌落数来获得，进而得到突变菌占总菌群的百分比。比例法药敏试验流程基础液改良L-J对照培养基含药培养基药物储存液混合、摇匀100ml1ml磨菌分装凝固分装凝固1mg/ml菌悬液10-4mg/ml

10-2mg/ml

100倍稀释100倍稀释接种0.01ml接种0.01ml2-3周新鲜菌落生物安全要求按照高致病性病原微生物的要求进行检测；实验室应为P2及以上级别的实验室，应有生物安全柜和防止气溶胶产生的仪器和设备；标准化的操作流程；良好的个人防护措施以及定期对操作人员进行体检并进行生物安全培训和教育；实验室应有完善的规章制度和应急预案等。结果报告按以下方式记录菌落生长情况：少于50个菌落：实际菌落数50-100个菌落：1+100-200个菌落：2+大部分融合（200-500个菌落）：3+融合（大于500个菌落）：4+结果报告

计算耐药百分比：含药培养基上生长的菌落数耐药百分比=--------------------------×100%

对照培养基上生长的菌落数若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。

绝对浓度法

该法是目前我国普遍采用的药敏试验方法。它是将一种浓度的细菌接种在二种浓度的含药培养基上，并以不含抗结核药物的培养基作对照。

判断标准是对照培养基上分支杆菌生长良好,含药培养基上菌落数≥20个判为耐药。

绝对浓度法药物浓度（ug/ml）

药名低浓度高浓度

INH110SM10100PAS110EMB550

RFP50250

绝对浓度法

结果报告按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况：分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面培养基斜面上菌落数少于20个时，报告菌落数。绝对浓度法

结果解释

敏感：培养基斜面上无菌落低浓度耐药：培养基斜面上菌落数（1+）~（4+）不等高浓度耐药：培养基斜面上菌落数（1+）~（4+）不等实报菌落数：含药培养基上菌落数<20个比例法和绝对浓度法的一致性综合以往国内有关比例法和绝对浓度法的试验报道，对2种方法研究结果显示,比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4药均高达96%以上,对于结核分支杆菌,二种方法测试H、S、R和E的耐药率均无显著性差异。我国逐渐用比例法替代绝对浓度法，将会使我们的药敏试验结果与国际接轨，与国际具有可比性，而不会影响到与我国既往资料的连续性和可比性。

分枝杆菌液体培养液体培养优势分枝杆菌生长更好比固体培养基的阳性率更高(15-30%)对非肺部样本,其检出率更高对涂片阴性样本,其检出率更高适用于更多种类的分枝杆菌生长报告时间更快(12-14天)更好和更快的药敏试验结果(6-12天)自动化肉汤系统Bactec460TBBBLMGITMGIT960VersaTREKBACT/ALERTMP系统检测方法放射测量法荧光测定法荧光测定法压力测量法比色法容纳能力60取决于人工960384240自动化半自动否是是是药敏试验是否是是是阳性检测方法

放射测量法放射标记的

CO2，使用ß-计数仪检测荧光测定法荧光可被培养基里的O2抑制，随着氧的消耗而释放出来比色法CO2的产生可改变传感器的颜色，被折光束检测出来

压力测量法随着气体产生压力增加，可被压力检测仪器检测出来阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook7H9肉汤上部空间已预先充填10%CO2BACTEC™MGIT™960操作系统

液体培养对象初诊的肺结核可疑症状者随访的肺结核患者痰标本采集、保存和运输痰标本采集：即时痰、夜间痰、晨痰痰标本保存：4℃保存运输（UN3373类包装）：3天内必