rp-hplc法测定人血浆中氢氯噻嗪的浓度

rp-hplc法测定人血浆中氢氯噻嗪的浓度

氢氯仿是一种含有氯仿的利尿剂。它影响肾小管对电解质的重吸收机制,直接增加钠和氯离子的等量排泄,造成体内Na+、水负平衡使细胞外液减少和血容量减少。既而增加血浆肾素的活性、醛固酮的分泌,致尿中钾离子的流失,降低血钾从而治疗高血压。本文建立了一种快速测定人血浆中氢氯噻嗪浓度的方法。1仪器、试剂和仪器HPLC系统:岛津LC-10ADVP双泵,岛津SPD-10AVP检测器,岛津DGU-14A脱气仪,天津奥特赛斯AT-330柱温箱,7125手动进样阀,浙江大学N2000色谱工作站,SANTAX不间断电源。梅特勒320pH计;IECCENTRA-7R冷冻离心机;梅特勒AE电子分析天平;Finnpipette200,1000μL连续可调节加样器;Cole-Parmer4721-00型多管涡旋器。氢氯噻嗪对照品、内标氢氟噻嗪对照品购自SIGMA公司(USP标准);乙腈、甲基叔丁基醚均为HPLC级,美国TEDIA公司生产;磷酸钠,分析纯,上海试剂二厂;四甲基氯化铵,分析纯,上海试剂一厂;磷酸,分析纯,杭州建德化工厂;氢氧化钠,分析纯,萧山化学试剂厂。2enexc38预柱的结构色谱柱为岛津Shim-packVP-ODS色谱柱(5μm,150mm×4.6mm),PhenomenexC18预柱(4mm×3.0mm);流动相:水-乙腈(85∶15),水相为pH=4.90的缓冲溶液(四甲基氯化铵4.8g、磷酸钠3.6g溶于1800mL去离子水中,以磷酸和氢氧化钠溶液调节pH至4.90),流速为1.0mL·min-1,检测波长271nm,柱温30℃,灵敏度为0.01AUFS。3溶液的制备3.1配制0.0.0%ml-1的储备液精密称取氢氯噻嗪对照品0.2500g,用甲醇溶解并转移至25mL量瓶,用甲醇定容至刻度,得浓度为10mg·mL-1的储备液。精密量取储备液适量,配制成浓度分别为100,10,1.0,0.5,0.1μg·mL-1的对照品溶液。3.2内标溶液的配制精密称取氢氟噻嗪对照品适量,加甲醇溶解定容,制成2mg·mL-1的内标储备液,取此储备液适量,用甲醇配制成浓度为2,4μg·mL-1的内标溶液。4方法和结果4.1有机约化剂为5%聚甲基苯磺酸盐缓冲液dsc-ms在10mL玻璃试管中加入4μg·mL-1内标溶液25μL,N2吹干。将冷冻血浆置于室温条件下使其融化,涡旋20s混匀,精密吸取0.5mL置于上述玻璃试管中,涡旋20s,加入甲基叔丁基醚5mL,涡旋2min,3000r·min-1离心5min,吸取上层有机相约4mL置5mL玻璃样品瓶中,40℃水浴下N2吹干。加入200μL流动相重组,取50μL进样。4.2血样的线性回归分析t取氢氯噻嗪对照品溶液和内标溶液适量,N2吹干,依次加入500μL空白血浆制成浓度分别为2,5,50,100,200,300,400ng·mL-1的对照品血浆各5份按“4.1”项下方法操作,以氢氯噻嗪峰面积对内标氢氟噻嗪峰面积的比值(Y)对氢氯噻嗪浓度(X)用加权最小二乘法(权重因子1/X)进行线性回归,得回归方程:Y=5.142×10-3X-0.0019r=0.9991结果表明,在2.0～400.0ng·mL-1浓度范围内峰面积比与氢氯噻嗪血浆浓度呈良好的线性关系,最低定量浓度(S/N=10)为2.0ng·mL-1。4.3平均加收率和rsd在同一天内对标准曲线范围内不同浓度氢氯噻嗪对照品血浆各5份进行分析测定,结果表明,测定方法的日内平均回收率94.1%～109.0%,RSD均小于10%,结果见表1;连续5d对5,100,300ng·mL-1氢氟噻嗪对照品血浆各5份进行测定,结果表明,测定方法的日间平均回收率为100.3%,108.8%,103.0%,RSD均小于6%,结果见表1。4.4提取回收率试验用空白血浆精密配制浓度分别为为5,100,300ng·mL-1的对照品血浆(n=5),按“4.1”项下方法处理,另取空白血浆按“4.1”项下方法处理,N2吹干前加入和配制对照品血浆相同的氢氯噻嗪对照品溶液,计录氢氯噻嗪的峰面积,两者比值即为氢氯噻嗪的提取回收率,结果见表1。4.5溶液稳定性测定配制浓度分别为5,100,300ng·mL-1的对照品血浆各12份,置于-20℃低温冰箱内冷冻保存,在30d内不同时间(0,10,20,30d)分别取样3份,按“4.1”项下方法操作,计算浓度,3种不同浓度的对照品血浆在不同时间点测得值的RSD分别为7.6%,4.3%,6.9%,说明氢氯噻嗪血浆在-20℃条件下放置30d稳定。4.6对照品血浆中氢氯噻嗪-内标溶液的制备取空白血浆500μL,按血浆样品预处理方法处理,得空白血浆色谱图1-A;取一定浓度的氢氯噻嗪溶液适量和内标溶液,加入人空白血浆中得100ng·mL-1对照品血浆,同法操作得对照色谱图1-B;取用药后人血浆处理得样品色谱图1-C。图示1号峰为氢氮噻嗪,2号峰为内标氢氟噻嗪。结果表明血浆中内源性物质及同服的药物对氢氯噻嗪的测定均无明显干扰。5药动学参数拟合本研究经浙江省医学科学院伦理委员会批准,9名健康志愿者在签署知情同意书后分3次交叉口服氢氯噻嗪片6.25,25,50mg,给药前及给药后0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12,18,24,36,48,72h取静脉血约4mL,离心取血浆冷冻保存待测。采用3P97程序拟合药动学参数,见表2。9名受试对象的平均药时曲线见图2,结果显示氢氯噻嗪在人体的药代动力学过程较好地符合开放的二室模型,且在服药剂量范围内氢氯噻嗪在人体呈现线性代谢的特征。6化合物离子法氢氯噻嗪分子结构中含有磺酰基,由于其吸电子效应,使氢氯噻嗪具有一定的酸性。曾尝试用离子抑制来分