比色法测定土壤腐殖质组分方法的比较研究

比色法测定土壤腐殖质组分方法的比较研究

土壤有机质含量是土壤肥力的重要指标之一。土壤腐殖质是土壤有机质的主要组成部分。研究土壤腐殖质的组成及性质变化历来为人们所重视[1~4]。土壤腐殖质由胡敏酸、富里酸、胡敏素等组成,土壤腐殖质的分组测定常用0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L氢氧化钠混合液提取腐植酸(胡敏酸+富里酸),在此条件下,能将土壤中的难溶于水和易溶于水的结合态的腐殖质络合成易溶于水的腐植酸钠盐,用酸将胡敏酸沉降出来,再将沉淀用氢氧化钠溶解成为胡敏酸钠盐[本文将碱溶出的腐殖质称“腐植酸”,其后用酸沉淀出的组分(黑腐酸+棕腐酸)称“胡敏酸”]。腐植酸、胡敏酸的有机碳量一般用重铬酸钾容量法测定。富里酸含量可由腐植酸含量减去胡敏酸含量计算。但重铬酸钾容量法测定腐植酸中有机碳量对温度、时间等氧化条件要求严格,操作繁琐,测定时间长,而且还会产生对环境有害的Cr6+污染。土壤腐植酸为棕褐色,在一定的浓度范围内,腐植酸颜色深浅基本上与其含量成正相关。因此,可用分光光度法直接测定土壤腐植酸含量以及胡敏酸和富里酸的含量。采用比色法测定腐殖质组分,操作简便,实验步骤容易掌握,测定的灵敏度和准确度较高、干扰少,而且可以节约能源、时间并减少环境污染和消除实验中的安全隐患。尽管对腐植酸及其组分的研究已发展到采用现代技术分析腐植酸含量及组分的结构组成,但采用简单快速的手段研究腐殖质组分和改进测试方法,仍然是需要探索的内容。本研究将腐殖质测定的比色分析结果与经典的重铬酸钾容量法测定结果加以比较,以期该比色测定方法能够推广,作为土壤腐殖质组分测试新方法的尝试。1材料和方法1.1样品的来源供试土壤来源于中国农业科学院国家测土施肥中心实验室,黑土取自吉林和黑龙江,红壤取自湖南、湖北和江西,潮土取自河南和河北(共40个样品),土样风干过60目筛。1.2中和酸/中和碱计算主要仪器:分光光度计、恒温震荡器、恒温箱、油浴锅。主要试剂包括腐植酸提取剂:c(Na4P2O7)=0.1mol/L,c(NaOH)=0.1mol/L;中和酸:0.5mol/LH2SO4;中和碱:1.0mol/LNaOH;其他反应试剂:0.025mol/LH2SO4溶液,0.05mol/LNaOH溶液,0.20mol/LFeSO4溶液,0.4000mol/L重铬酸钾溶液,邻啡琳指示剂,浓硫酸(比重1.84,分析纯)。1.3实验方法1.3.1胡敏酸、富里酸标准溶液的配制实验选择有代表性的、有机质含量较高的土样提取腐植酸并作为分离富里酸、胡敏酸标准样品的材料。土样为黑土,取自黑龙江宝清县,土壤pH值5.9、有机质含量4.56%,用腐植酸提取剂(0.1mol/LNa4P2O7+0.1mol/LNaOH)提取腐植酸并分离得到富里酸、胡敏酸溶液,再用重铬酸钾氧化-容量法测定腐植酸、富里酸和胡敏酸的有机碳含量,根据制备的腐植酸、富里酸、胡敏酸标样的有机碳含量准确稀释分别得到标准系列。(1)标准溶液的制备。称量50g土壤样品于500mL三角瓶中,加入250mL腐植酸提取剂,震荡1h,在20~25℃室温静置过夜,虹吸瓶中上部清液于烧杯中,一份不分离作为腐植酸的标准溶液,转入塑料瓶中,放入温度小于5℃冰箱中保存。另一份加中和酸滴定至pH=3.0(pH计检验),记录所用中和酸体积,加盖密封,置于80℃恒温箱中保温30min,静置过夜。用慢速滤纸过滤于烧杯中,在滤液中再加入与前所耗中和酸等体积的中和碱(加碱以利于富里酸溶液的保存),转入塑料瓶中,在温度小于5℃的冰箱中保存。此即作为富里酸的标准溶液。将滤纸及其上残渣连同漏斗转入三角瓶上,用0.025mol/LH2SO4洗涤至滤液无色,弃去滤液(目的是洗净滤纸及残渣上残留的富里酸溶液),将滤纸、残渣连同漏斗放到另一三角瓶上。以刚沸腾的0.05mol/LNaOH溶液洗涤至滤液基本无色,冷却后储于塑料瓶中,放入温度小于5℃冰箱中保存。此即作为胡敏酸的标准溶液。(2)胡敏酸、富里酸标准溶液浓度的标定。分别取上述制备的腐植酸、富里酸和胡敏酸标液2~10mL(视颜色深浅而定)于50mL三角瓶中,调节酸度为中性。在60℃的恒温水浴中蒸干,然后加5mL重铬酸钾溶液,再加入5mL的浓硫酸(1.84g/L),摇匀,加弯管漏斗做回流装置,同时做空白对照,在170~180℃的油浴中,溶液沸腾开始记时,5min后取出,冷却后转入250mL的三角瓶中,用0.2mol/LFeSO4滴定剩余的重铬酸钾溶液。求出腐植酸、富里酸和胡敏酸标液的浓度(有机碳量)。根据腐植酸、富里酸和胡敏酸标液的浓度再准确稀释配成如下标准系列:a.腐植酸系列标准溶液:0、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL(用腐植酸提取剂稀释定容);b.富里酸和胡敏酸系列标准溶液:0、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、80.0μg/mL、100μg/mL(富里酸系列标准溶液用腐植酸提取剂稀释定容;胡敏酸系列标准溶液用0.05mol/LNaOH溶液稀释定容)。1.3.2含富里酸的试液的制备称重5g试样于250mL三角瓶中,加入100mL腐植酸提取剂,振荡30min,在20~25℃室温下静置13~14h,然后摇匀,以慢速滤纸过滤(弃去数毫升初始滤液)。滤液即为腐植酸试液。吸取腐植酸试液20mL于50mL烧杯中,搅拌下滴加中和酸至pH=3.0(pH计检验),并记录下用酸量V(mL),然后置于80℃恒温干燥箱里,保温30min,静置过夜。第二天将溶液用慢速滤纸过滤,再用0.025mol/LH2SO4洗涤沉淀至滤液无色,将滤液置于100mL容量瓶中,滤液中加与中和酸等量的中和碱(加碱以利于富里酸的保存),用腐植酸提取剂定容至刻度,摇匀得到含富里酸的试液。将滤纸、沉淀连同漏斗转至另一100mL容量瓶中,用刚沸腾的0.05mol/LNaOH溶液少量多次洗涤滤纸和沉淀,直至滤液和滤纸无色,放置至室温,用0.05mol/LNaOH溶液定容至刻度,摇匀得到含胡敏酸试液。1.3.3回流体的制备分别吸取腐植酸、富里酸以及胡敏酸标准溶液5~50mL(视有颜色深浅而定)于100mL三角瓶中,调节酸度为中性。在60℃的恒温水浴中蒸干,然后加5mL重铬酸钾溶液,再加5mL的浓硫酸,摇匀,加弯管漏斗做回流装置。同时做空白,放入170~180℃的油浴中,溶液沸腾开始记时,5min后取出。冷却后转入250mL的三角瓶中,用0.2mol/LFeSO4滴定剩余的重铬酸钾,根据滴定体积计算腐植酸、富里酸和胡敏酸溶液的浓度。1.3.4土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸含量的测定将已制备的腐植酸、富里酸和胡敏酸标准系列溶液和样品,用比色法测定460nm波长下的吸光度,根据标准曲线计算样品溶液中腐植酸、富里酸和胡敏酸的浓度以及土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸的含量。如果测定时吸光度过高,可将标准溶液和样品稀释后再测定。2结果与分析2.1腐植酸与富里酸含量的相关分析在分光光度计上460nm处测定各组分各浓度的吸光度,绘制腐植酸、富里酸和胡敏酸标准溶液曲线,结果见图1~图3。由图1~图3可以看出,腐植酸浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9997,直线回归方程为:y(μg/mL)=81.28x-0.2644;富里酸浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9995,直线回归方程为:y(μg/mL)=298.1x-0.0318;胡敏酸浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9997,直线回归方程为:y(μg/mL)=58.928x-0.4522。2.2不同土壤类型微生物指标的影响根据以上建立的腐植酸、富里酸和胡敏酸溶液标准曲线,用比色法测定并计算了40个土壤样品包括黑土、红壤和潮土提取的腐植酸、富里酸和胡敏酸的含量。同时,用重铬酸钾-容量法测定所有供试土样的腐植酸、富里酸和胡敏酸的含量,比较两种方法在不同土壤类型上的相关性和差异性。见图4~图6。实验结果显示,用比色法测定和用容量法测定腐植酸含量呈极显著相关(图4),复相关系数R2=0.9529,相关回归直线方程为:y=0.9508x+1.0123;用比色法测定和容量法测定富里酸含量呈极显著相关(图5),复相关系数R2=0.7049,相关回归直线方程为:y=0.6166x+1.2684;用比色法测定和容量法测定胡敏酸含量呈极显著相关(图6),复相关系数R2=0.8845,相关回归直线方程为:y=0.8121x+2.2393。可见,比色法测定和容量法测定相关显著性为腐植酸>胡敏酸>富里酸。按不同土壤类型用比色法与容量法分别分析腐植酸、富里酸和胡敏酸,结果相关性见表1。可以看出,黑土和红壤中腐植酸、富里酸和胡敏酸用比色法与容量法测定,结果皆呈显著相关,且相关系数高。说明在这两类土壤中,用简便、快速的比色法估测土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸的含量可行。对于潮土,除腐植酸两种方法测定结果达到极显著相关外,富里酸两种方法测定结果仅达到显著相关,而胡敏酸两种方法相关系数低于5%。3要重视比色法测定土壤有机质组分的研究(1)腐植酸、胡敏酸和富里酸在460nm处的比色结果与重铬酸钾容量法有很好的相关性。通过比色方法可以简便、快速、准确估测土壤腐殖质(酸)含量、组成。比色法测定腐植酸含量对土壤肥力研究和评价有着重要意义,为高效土壤测试技术开拓了新方法。用比色法测定土壤腐殖质含量在国外早已有研究并应用到田间有机质速测方法中,这里进行的相关研究是进一步探讨比色法测定土壤腐殖质组分的尝试。(2)用比色法测定腐植酸含量,标准样品的选择非常重要。不同类型土壤腐殖质化学组成、结构和性质不同,同一地带的土壤腐殖质组成结构和性质也可能因土壤母质的不同而不同。因此,在选择参比土样提取分离腐植酸、胡敏酸和富里酸建立标准系列时,除了选择有机质含量相对较高的土壤外,还应选用与研究对象同一类型的土壤提取的腐植酸、胡敏酸和富里酸做标准样品制作标准曲线,以消除不同土壤类型腐植酸、富里酸差异以及腐植酸化学结构的差异可能导致的吸光度偏差,从而给测定结果带来的影响,提高估测