药学分子生物学：第十章 外源基因表达与基因工程药物

第十章外源基因表达与基因工程药物目录概述基因表达的原理基因表达的类型外源基因表达的基本过程目的基因的获得目的基因与表达载体的重组重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认目的基因的表达原核细胞表达系统表达载体表达宿主细胞真核细胞表达系统酵母细胞表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统重组基因工程药物重组人胰岛素及其突变体重组人凝血因子VIII重组人尿激酶与尿激酶原重组人生长激素第一节概述外源基因的表达利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。目的针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。基因工程概念基因工程（GeneticEngineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术基因工程的发展史一、基因表达基本原理基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。基因重组主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。基因工程核心是基因表达技术。二、基因表达基本类型原核细胞表达系统真核细胞表达系统大肠杆菌系统芽孢杆菌系统溶解状况表达位置结构状态转基因动植物酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统包涵体可溶性胞内定位分泌非融合表达融合表达第二节外源基因表达基本过程外源基因表达实现外源基因的表达，就是利用基因工程技术，将编码外源蛋白的基因与特定的表达载体重组，运用相应技术将重组表达载体导入特定的宿主细胞，重组表达载体以游离形式存在于宿主细胞内；或者含有外源基因转录单位的单元，通过细胞内DNA重组过程整合到宿主细胞染色体DNA中，利用特定诱导表达单元及其调控系统，实现外源蛋白的诱导表达；或者依据宿主细胞的自然状况实现表达。四个要素工具酶载体目的基因受体（宿主）细胞基因工程的基本过程目的基因的获取：从生物体中分离或人工合成重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体重组DNA分子导入合适的受体细胞：重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增重组体的筛选与确认：直接筛选法（如抗药标志选择）和免疫学方法等目的基因的表达：原核与真核表达一、目的基因的获得外源基因表达的第一步是获得目的基因获得目的基因的主要方法包括：①化学合成②RT-PCR从含有目的基因的总RNA或mRNA中扩增③从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增④通过杂交技术筛选⑤利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选聚合酶链式反应(PCR)PCR（polymerasechainreaction）:在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。原理在适当缓冲液（Mg2+）反应体系中，根据碱基配对原理利用DNA聚合酶催化和dNTPs的参与下，引物依赖于DNA模板特性指导DNA合成基本步骤变性：双链DNA解离成为单链(90℃以上)退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（50℃左右）延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的互补链（70℃左右）PCR反应五要素引物、酶、dNTP、模板和Mg2+PCR反应的特异性决定因素：引物与模板DNA特异正确的结合碱基配对原则

TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性靶基因的特异性与保守性PCR的应用研究—基因克隆；DNA测序；分析突变诊断—细菌、病毒、寄生虫检测及诊断人类基因组工程—遗传图谱的构建；DNA测序；表达图谱法医—犯罪现场标本分析肿瘤—各种肿瘤检测其他……二、目的基因与表达载体的重组重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体。（一）载体对于外源基因的表达，第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。表达载体主要包括：质粒载体、噬菌体或病毒载体。表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。基因工程载体的基本条件能在宿主细胞中复制繁殖容易进入宿主细胞有合适的限制性核酸内切酶位点，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制有容易被识别筛选的标志容易从宿主细胞中分离纯化出来基因工程载体分类根据载体的分子生物学特性划分质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性根据载体功能划分：克隆载体—质粒、λ噬菌体、粘性质粒、M13噬菌体表达载体—大肠杆菌表达载体、哺乳动物细胞表达载体常用载体质粒(plasmid)

—独立于细菌染色体以外的遗传物质，能够自我复制的双链闭合环状DNA分子。大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子复制类型分为严紧型和松弛型有共价闭合环形、开环和线性三种构型泳动速度：SCDNA>LDNA>OCDNA质粒具有不相容性具有转移现象和迁移作用

噬菌体载体特点双链DNA分子（线性或环形）两端具有12个nt单链互补粘性末端具非必需区（中间区约1/3长度）可在E.Coli中大量繁殖可克隆15Kb左右的外源基因M13噬菌体(M13phage)只感染有F＋性菌毛的大肠杆菌噬菌体基因组DNA全长6.5kb（单链）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA）RF只有（+）链复制，相当于质粒载体优点：既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。缺点：插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。大容量载体细菌人工染色体(BACs):

E.coliF质粒，供体DNA>300kb,用于大基因组分析P1人工染色体(PACs)：噬菌体P1，需要体外包装盒转导，供体DNA约100kb,用于大基因组分析酵母人工染色体(YACs)：酿酒酵母着丝粒、端粒和自主复制序列，供体DNA>2000kb,用于大基因组分析和YAC转基因动物穿梭载体(shuttlevector)能在两种不同的生物中复制的载体具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状具有多克隆位点在细菌中用于扩增克隆的基因在真核生物中用于基因表达分析表达载体（Expressionvectors）真核细胞载体哺乳动物细胞的病毒载体含有原核基因序列即：复制子和抗性基因含有哺乳动物细胞启动子和增强元件使外源基因有效转录转录终止信号和poly(A)信号含有可选择的剪切信号含有一个以上的限制性酶切位点酵母载体组成—遗传标记；调控序列（ARS、环状质粒DNA、启动子）；由质粒DNA与酵母DNA重组的穿梭质粒杆状病毒载体—昆虫细胞多角病毒载体具有蛋白修饰、加工和转运体系产物可溶性表达适于克隆大片外源DNA不侵染脊椎动物真核细胞载体（二）重组体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于：选择合适的重组位点、剪切位点；以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ1）合成双链cDNA的第二条链；2）缺口平移制作高比活探针3）DNA序列分析4）填补3’末端反转录酶1）合成cDNA2）替代DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化、或标记探针末端转移酶在3’羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基基因工程相关酶学限制性核酸内切酶具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶Ⅰ型：修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性Ⅱ型：内切酶活性和修饰酶活性，专一性强。既具有切割位点的专一性,也具有识别位点的专一性,一般在识别序列内切割Ⅲ型：作用方式同Ⅱ型命名方式Ⅱ型限制性核酸内切酶基本特性识别ds-DNA中含４-8个相连的碱基对组成的特定回文序列断裂后形成的DNA片段具有互补碱基的单链延伸末端（粘性末端）或平末端同裂酶(isoschizomer)—来源不同,识别和切割位点相同同尾酶(isoaudamers)—来源、识别序列和切割方式均不相同，但产生的限制性片段却是相同的粘性末端Ⅱ型限制性核酸内切酶限制性内切酶对DNA的消化作用及其片段化消化作用—以同型二聚体形式与靶DNA序列作用，所识别的靶序列大小决定着DNA片段的大小片段化:单酶切、双酶切、一部分酶切具有粘性末端DNA片段的连接不同的DNA片段通过互补的粘性末端配对连接—分子间连接同一片段的两个互补末端之间碱基配对形成环形分子内连接Ⅱ型限制性核酸内切酶载体与目的片段连接影响限制性内切酶活性的因素DNA的纯度DNA甲基化程度底物DNA的分子构型反应温度反应系统组成酶量、反应体积、酶切时间限制酶的用途

DNA重组与构建新基因组文库组建DNA物理图谱DNA分子杂交制备DNA放射性探针DNA序列分析Ⅱ型限制性核酸内切酶DNA连接酶

封闭DNA链上缺口酶，借助能量催化DNA链的5′-PO4与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键。用于DNA重组和质粒的构建

大肠杆菌DNA连接酶：只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子T4DNA连接酶：连接粘性末端，高浓度可连接平末端，要求3′-OH和5′-PO4

。催化过程需要ATP和Mg聚合酶以DNA(RNA)为模板，催化DNA(RNA)的体外合成特点：以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA需要模板和引物的存在不能起始合成新的DNA链催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端催化DNA合成的方向是5'→3'聚合酶的分类及特点大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：

5′→3′的聚合作用3′→5′的外切酶活性5′→3′外切酶活性Klenow聚合酶：5′→3′聚合酶活性3′→5′外切酶活性没有5′→3′外切酶活性用于填补DNA单链末端成为双链聚合酶的分类及特点T4-DNA聚合酶：无5′→3′外切酶活性、需要一条有引物的单链DNA作模板、3′→5′外切酶活性TaqDNA聚合酶：5′→3′聚合酶活性5′→3′外切酶活性，有链置换合成能力不具有3′→5′外切酶活性，没有校正功能良好的热稳定性用于DNA序列分析和PCR反应逆转录酶（reversetranscriptase）

两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV)moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)

作用：以RNA为模板合成DNA,构建cDNA文库RT-PCR制备杂交探针以RNA为模板合成DNA的酶(RNA指导的DNA聚合酶)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）：去除DNA/RNA5′-P，制备载体时可防止载体自身连接，提高重组效率末端脱氧核苷酰转移酶：在DNA的3＇-OH上，加上dNTPDNA和RNA的修饰酶宿主细胞宿主细胞（HostCell）指接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。分类真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。原核细胞：大肠埃希氏菌、枯草杆菌等。宿主细胞基因工程使用的宿主细胞除了基本的人为改造外，还会针对具体目的加以改造。特点限制性内切酶缺陷型抑郁重组子导入遗传稳定性好安全性高功能互补较好的翻译后加工机制蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低重组分子导入受体细胞转导(transduction)指噬菌体颗粒感染宿主细胞，通过特定的途径，将噬菌体核酸注入宿主细胞内的过程，并使噬菌体核酸在宿主细胞内实现复制、转录、翻译或子代噬菌体的繁殖。转化(transformation)指感受态细胞接纳外源DNA分子的过程，并使其在宿主细胞内实现复制、扩增、转录与翻译。感受态(competence):细胞在一定生理状态时可摄取外源性遗传物质，并使受体细胞产生新的遗传性状。电转化利用电穿孔法，将外源DNA或载体DNA导入宿主细胞，并使载体DNA在宿主细胞内实现复制、扩增、转录与翻译，该方法也称电穿孔转化法。重组分子导入受体细胞阳性脂质体及其介导的基因转染DNA-磷酸钙转染法DEAE葡聚糖转染法显微注射重组体的鉴定和分析生物学方法：表型筛选、抗药性、缺陷基因的功能互补表型、噬菌斑的变化、报告基因免疫学方法：放免、化学方法、显色反应核酸杂交法：Southern,Northern、菌落原位杂交PCR技术限制性酶切鉴定测序目的基因表达

原核细胞 真核细胞

原核生物与真核生物基因表达的主要差别原核生物真核生物mRNA一条mRNA编码几种蛋白质（多顺反子）一条mRNA编码一种蛋白质（单顺反子）转录后很少加工转录后进行首尾修饰及剪接转录、翻译和mRNA的降解可同时发生mRNA在核内合成，加工后进入胞液，再作为模板指导翻译核蛋白体30S小亚基，50S大亚基，70S核蛋白体40S小亚基，60S大亚基，80S核蛋白体起始阶段起始氨基酰-tRNA为fMet-tRNAfMet起始氨基酰-tRNA为Met-tRNAiMet核蛋白体小亚基先与mRNA结合,再与fMet-tRNAfMet结合核蛋白体小亚基先与Met-tRNAiMet结合，再与mRNA结合mRNA中的S-D序列与16SrRNA3-端的一段序列结合mRNA中的帽子结构与帽子结合蛋白复合物结合有3种IF参与起始复合物的形成有至少10种eIF参与起始复合物的形成延长阶段延长因子为EF-Tu、EF-Ts和EF-G延长因子为eEF-1α、eEF-1βγ和eEF-2终止阶段释放因子为RF-1、RF-2和RF-3释放因子为eRF翻译后修饰修饰少多种修饰方式表达系统原核细胞表达系统大肠埃希氏菌表达系统S30T7HighYieldProteinExpressionSystem芽孢杆菌表达系统真核细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统AdEasyAdenoviralVectorSystem昆虫细胞表达系统BactoBacExpressionSystem酵母细胞表达系统重组基因工程药物目前已有许多种基因工程药物获准上市。多肽、蛋白质、酶类药物，通过各式各样的基因表达系统实现了表达，并获准上市。重组基因工程药物的生产技术上游技术：表达系统的选择；目的基因和载体的重组；重组载体导入宿主细胞；筛选含有表达载体的宿主细胞；通过调控表达载体的启动子，实现外源基因的表达。下游技术：基因工程细胞的产业化培养，以获得外源基因的高效表达；产业化水平的表达产物的分离纯化，使表达产物的纯度和质量达到原料药规定的质量标准。一、重组人胰岛素及其突变体1923年，从动物中提取的胰岛素在美国上市。1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成。1979年，RutterW等克隆了胰岛素基因。1982年，第一个重组人胰岛素批准上市。近年来，重组人胰岛素尤其是突变体产品，在市场销售份额逐年递增。一、重组人胰岛素及其突变体概述糖尿病属内分泌代谢疾病，初期表现为高血糖，并可继发引起脂肪和蛋白质代谢异常，如动脉粥样硬化，视网膜和肾脏病变，外周神经病变。I型、II型糖尿病对胰岛素的依赖。重组人胰岛素的制备方法传统方法及其局限性。包涵体表达胰岛素原表达酵母菌表达一、重组人胰岛素及其突变体重组人胰岛素的应用控制糖尿病最有效的药物。Aspart（门冬胰岛素，Novolog®

）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA（赖谷胰岛素，Apidra®

）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。Lispro（赖脯胰岛素，Humalog