丹莪妇康煎膏对子宫内膜异位症大鼠基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响

丹莪妇康煎膏对子宫内膜异位症大鼠基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响

子宫内膜综合征（iu）是妇女的常见病。近年来，发病率显著增加，引起了学术界的关注，但其发病机制尚不清楚。Sampson最早提出了子宫内膜种植学说,月经期脱落的子宫内膜碎片,随经血逆流经输卵管进入腹腔,种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜,并继发生长和蔓延,发展成EMS。在这一过程中,脱落的子宫内膜碎片的迁移和侵袭能力至关重要。而异位内膜的基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)之间的平衡失调,会促进细胞外基质降解,增加异位内膜侵袭力。可见,MMPs/TIMPs系统在EMS的发生、发展过程中具有重要的作用。丹莪妇康煎膏(DFD)为临床治疗EMS的常用中药,能活血化瘀,疏肝理气,调经止痛,软坚化积。我们前期研究发现,其对EMS大鼠有较好治疗作用,但作用机制不明。本实验采用子宫内膜自体移植法建立大鼠EMS模型,通过观察丹莪妇康煎膏对EMS大鼠异位子宫内膜组织MMP-9和TIMP-1mRNA表达的影响,探讨其防治EMS作用的机制。1材料表面1.1syxk冀Wistar大鼠,清洁级,雌性,180～200g[河北省实验动物中心,实验动物使用许可证SYXK(冀)2006-0047,动物合格证号1009075]。饲养于温度20～23℃,湿度45%～60%,过氧乙酸溶液消毒环境。1.2孕三烯酮和庆大霉素丹莪妇康煎膏(昆明滇虹药业有限公司,批号100404);孕三烯酮(北京紫竹药业,批号53110101);庆大霉素(石家庄制药集团有限公司,批号068100905);苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份有限公司,批号009004)。1.3timp-1扩增片段的构建RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司];Trizol(美国Invitrogen公司);PCR引物序列:MMP-9上游引物:5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTA-3′,下游引物5′-AGGATTGTCATCTGGAGTCGA-3′,预扩增片段为619bp;TIMP-1上游引物:5′-GCTAAATTCATGGGTTCCCCAG-3′,下游引物5′-TTGCTGAGCAGGGCTCAGATTA-3′,预扩增片段为279bp;β-actin上游引物5′-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′,下游引物5′-GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3′,预扩增片段为576bp。1.4pcr扩增及衍射分析超净工作台(苏州净化设备有限公司);756MC型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);PE9600型PCR扩增仪(美国PE公司);电泳仪及电泳槽(北京六一仪器厂);BIO-PROFIF凝胶图像分析系统(法国VL公司);紫外透射仪(北京鼎国昌盛生物制品有限公司);MDF-382E超低温保存箱(日本SANYO公司);1-15K高速冷冻离心机(美国Sigma公司)。2方法2.1患者安氏肌肉注射给予大鼠精子组织及术后观察采用自体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠2mL·kg-1,待麻醉后固定于操作板上。开腹找到子宫,暴露左侧子宫,在离卵巢约1cm处,分离附着于子宫肌壁的脂肪和结缔组织,两端分别用手术线结扎,剪取中间约1cm长子宫组织,纵向剖开宫腔,暴露子宫内膜,切取5mm×5mm的子宫壁块。在腹壁切口右侧的腹肌与皮下筋膜层之间打隧道,以正好能置入子宫壁块为宜,将子宫壁块平整的置入右侧隧道底部,使内膜面紧贴腹肌,常规关闭腹腔。假模型组按上述方法切取子宫组织,丢弃,关腹,其他操作同上。术后,每只大鼠腹腔注射庆大霉素0.4万单位,连续5d。术后次日,各鼠肌肉注射雌二醇0.1mg·kg-1,每隔4d1次,共3次,以促进移植内膜的生长。术后每周触摸包块2次,观察是否出现包块及包块的体积变化。术后第21天,将大鼠麻醉后固定,开腹,观察异位内膜形态学变化。以游标卡尺测量异位内膜组织体积,若体积增大≥8mm3,并出现液体积聚,隆起呈透明小囊状,则为造模成功。2.2单次给药剂量ldf取造模成功的大鼠40只,随机分为模型组(MG),丹莪妇康煎膏高剂量组(DFD-H,6g·kg-1·d-1)、低剂量组(DFD-L,3g·kg-1·d-1)、孕三烯酮组(GSG,1.25mg·kg-1·d-1),每组10只。另设假手术组(SHM)大鼠10只。各组大鼠每日灌胃给药(或蒸馏水)1次,给药容量为10mL·kg-1,连续30d。末次给药后禁食12h,麻醉,开腹,快速剪取异位子宫内膜组织,假手术组剪取在位子宫内膜组织,用高温灭酶的铝箔纸密封包裹,-80℃冻存。2.3mmp-1-actinTrizol法提取总RNA,逆转录合成cDNA,进行PCR扩增。RT-PCR条件:MMP-9:94℃变性3min;94℃40s,55℃退火50s,72℃90s,循环30次;72℃延伸10min。TIMP-1:退火温度为58℃,其他条件同MMP-9;β-actin:退火温度为59℃,其他条件同MMP-9。反应结束后,PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,以DNAMarker(DL2000)作为标准片段标记,电泳后于紫外透射仪观察,并用数码相机照相,输入微机应用QuantityOne凝胶图像分析软件对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。2.4分析过程统计结果用(ˉx±s)表示,采用SPSS11.5进行分析。所有数据先行正态性和方差齐性检验,各组间比较采用单因素方差分析,样本均数间的两两比较采用LSD-t检验。3结果3.1各组大鼠精子内皮中mmp-9mrna表达的比较模型大鼠异位子宫内膜组织MMP-9mRNA的表达量明显高于假手术组大鼠子宫内膜组织中的表达量(P<0.01)。丹莪妇康煎膏各剂量组及孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织MMP-9mRNA的表达量较模型组显著降低(P<0.01)。结果见表1、图1。3.2各组大鼠精子内皮组织timp-1的表达量模型大鼠异位子宫内膜组织TIMP-1mRNA的表达量明显低于假手术组大鼠子宫内膜组织中的表达量(P<0.01)。丹莪妇康煎膏各剂量组及孕三烯酮组大鼠异位子宫内膜组织TIMP-1mRNA的表达量较模型组显著升高(P<0.01)。结果见表2、图2。4储底膜的活性EMS是一种危害妇女健康的常见病、多发病。正常情况下,子宫内膜覆盖于子宫体腔面,如因某些因素,使子宫内膜在身体其他部位生长,即可成为EMS。EMS可致痛经并进行性加重,还可引起月经不调、性交痛、不孕等症状,虽为良性疾病,但具有增生、浸润、转移及复发的特点,病情迁延,严重影响妇女的身心健康及家庭幸福。研究人员虽已对EMS进行了多方面的研究,但其发病机制仍众说纷纭,没有定论。其中,子宫内膜种植学说是EMS发病的主导理论,认为脱落的子宫内膜碎片由输卵管流入腹腔,种植在盆腔脏器表层而形成病灶。但流入腹腔的内膜组织必须降解基底膜及其他细胞外基质成分才能完成种植。MMP是催化细胞外基质降解的主要酶类之一,几乎能降解细胞外基质的所有成分。其中,MMP-9是降解细胞外基质最重要的酶类之一,它参与了细胞外基质主要成分IV型胶原的降解,并能促进血管内皮细胞出芽以及新生血管形成,促进EMS异位内膜的形成和生长。而TIMP则是一类蛋白酶抑制剂,能抑制MMP的活性。其中,TIMP-1能够与活化的MMP-9形成复合物而抑制其活性,降低细胞外基质的降解,抑制新生血管形成。现代研究发现,EMS患者异位内膜可表现出MMP-9表达增强,而TIMP-1表达降低,细胞外基质降解增多,导致异位内膜侵袭性生长。本实验结果也显示,模型大鼠异位子宫内膜组织MMP-9mRNA的表达明显高于假手术组大鼠子宫内膜组织中的表达(P<0.01),而TIMP-1mRNA的表达则明显低于假手术组大鼠子宫内膜组织中的表达(P<0.01),这与临床研究结果相吻合,说明MMP-9/TIMP-1比例的升高与EMS的发病密切相关。丹莪妇康煎膏为临床治疗EMS的常用中药,是由紫丹参、莪术、竹叶柴胡、三七等中药组方而成,具有活血化瘀、疏肝理气、调经止痛、软坚化积等功效。经前期研究发现,丹莪妇康煎膏对EMS模型大鼠有较好治疗作用,但作用机制不明。本实验采用子宫内膜自体移植法建立大鼠EMS模型