内异康复栓直肠给药对子宫内膜异位症模型大鼠cyc、survilin表达的影响

内异康复栓直肠给药对子宫内膜异位症模型大鼠cyc、survilin表达的影响

子宫内膜组（pmt）引起的疼痛、妊娠、慢性骨盆疼痛和性交痛严重影响了女性的生殖健康和生活质量。它被称为良性癌症。本病具有类似恶性肿瘤的侵袭性、种植性和复发性,因此推测EMT的发生可能与凋亡调控基因有关。子宫内膜细胞自发性凋亡是内膜组织保持正常结构和功能的关键因素,而凋亡异常可促进EMT的发生和发展。细胞色素C(cytochromeC,cytC)是线粒体启动凋亡程序的关键物质之一,在细胞凋亡中发挥至关重要的作用;生存素(Survivin)属凋亡抑制蛋白家族的一员。内异康复栓具有清湿化瘀、行气止痛、消癥散结之功效,经直肠给药治疗EMT具有较好疗效。本实验对内异康复栓进行疗效机理的研究,采用免疫组化SP法检测内异康复栓直肠给药对cytC和Survivin在EMT大鼠异位、在位子宫内膜表达的影响。材料和方法1实验动物及膜质健康性成熟未交配过的雌性SD大鼠45只,体重180~250g,清洁级动物,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第8号,批号:SCXK(川)2004-11。2其他药品内异康复栓浸膏:由大血藤(Coulissargentodoxae)、丹参、三棱、土鳖虫等组成,成都中医药大学附属医院制剂室提供(批号:050928);丹莪妇康煎膏:由紫丹参、莪术、竹叶柴胡、三七、赤芍、当归、三棱、香附、延胡索、甘草组成,昆明滇虹药业有限公司生产(生产批号:050503);丹那唑胶囊:上海华联制药有限公司生产(生产批号:050301)。3robcoligg2b的合成一抗购自SantaCruzBiotechnology,INC公司:Survivin(FL-142)rabbitpolyclonalIgG,200μg/mL;cytochromeC(A-8)mousemonoclonalIgG2b200μg/mL;二抗及相应试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。4图像分析系统光学显微镜,型号:BH-2;数码摄像机,型号:TK-C1381EG;BIOMIAS图像分析系统;切片机,型号:AO.802;切片漂烘控温仪,型号:QO-B;脱水机,型号:TS-12G;包埋机,型号:BMJ-3。5内异康复栓浸膏组模型组采用自体移植法建立EMT大鼠模型,30天后随机抽取动物剖腹证实模型成功后,随机分为内异康复栓高剂量[4.0g/(kg·d)],内异康复栓低剂量组[2.0g/(kg·d)],丹那唑组[0.2g/(kg·d)],丹莪妇康煎膏组[10.0g/(kg·d)],模型组和空白组。内异康复栓浸膏高、低剂量组直肠给药,丹莪妇康煎膏组和丹那唑组灌胃给药,模型组和空白组灌肠与内异康复栓高、低剂量组等容积的生理盐水。直肠给药前轻轻按摩并挤压大鼠肛门周围,促使直肠内积存的粪便排出,然后将直肠给药针头轻轻插入大鼠直肠约4.5cm,将药液缓缓推入,同时观察实验动物的状态,给药后观察30min,若有药液排出,即予补量。造模后30天开始给药,持续给药30天。6灶内膜组织和瞳检组织于末次给药后24h脱颈椎处死大鼠,立即剖腹取异位病灶内膜组织和在位子宫送检。依据造模后病理组织形态学检查抽样结果,选取左侧子宫中段旁肠系膜异位内膜病灶及同侧子宫中段作为标本,置于10%中性福尔马林液中固定,送检。7免疫组化染色将剖腹取出的异位种植内膜组织和左子宫(非手术侧)置于10%中性福尔马林液中固定,48h后取出,经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚4μm),采用免疫组化SP法染色。采用Mias图形分析系统,在200倍视野下,分别选择在位内膜组织的腺体中和异位内膜组织的被覆上皮含阳性物质(即棕黄色颗粒物质)最多的5个区域观察,测定cytC和Survivin的表达[积分光密度(Integralopticaldensity,IOD)值]。8统计学处理方法所有数据均采用SPSS12.0统计软件进行处理,定量指标取对数后用单因素方差分析,组间比较用LSD、S-N-K分析和Tamhane’sT2检验。结果1各组正常组织形态变化异位内膜:模型组子宫内膜形成环形封闭式结构,较在位内膜稍薄,宫腔被覆上皮呈假复层,部分呈复层排列,细胞拥挤,呈柱状,血管丰富;各治疗组异位内膜腺上皮变薄,呈单层排列,细胞呈低柱状甚至扁平状松散排列,细胞核呈圆形或椭圆形,间质细胞明显减少,甚至缺如,周围血管少。在位内膜:模型组腺体数目与空白组接近,腺上皮细胞立方状,排列较紧密,间质细胞呈梭状,排列紧密;各中药治疗组在位内膜腺体数目和腺上皮细胞及间质细胞与空白对照组比较无明显改变;丹那唑组在位内膜腺体数目减少,有的腺腔消失,腺上皮细胞呈低柱状或扁平,排列稀疏,核小,染色浅,胞浆稀少,间质细胞呈长梭状,排列稀疏,染色浅。2原位cytc表达的变化与模型组比较,内异康复栓高、低剂量组异位内膜cytC的表达均显著增加(P<0.01);Survivin表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。3各组大鼠载体cytc表达比较与模型组比较,内异康复栓高、低剂量组能显著上调模型大鼠在位内膜下降的cytC水平(P<0.05),与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);丹那唑组与空白组及内异康复栓高、低剂量组比较,大鼠在位内膜cytC表达显著增加(P<0.05)。内异康复栓高、低剂量组大鼠在位内膜Survivin表达有下调趋势,与模型组和空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。不同模型大鼠体外凋亡的影响EMT是一种始于细胞水平而终止于以盆腔疼痛和不孕为特点的持续性病变,其发病机理尚不完全清楚,目前多数学者认为,本病可能是一种在免疫及细胞凋亡异常基础上发生经血逆流而导致的综合结果,因其发病机制尚未完全阐明,临床上尚无有效的根治措施。凋亡是子宫内膜细胞保持周期性结构和功能稳定的关键因素,异位内膜细胞得以在宫腔外种植并继续存活,与其对凋亡的抵抗力增强有关。cytC是呼吸链中的一个基本成分,在细胞氧化还原和能量代谢中起着重要的作用,同时cytC又是线粒体启动凋亡程序的关键物质之一,在细胞凋亡中发挥着至关重要的作用。cytC与bcl-2家族关系密切,bcl-2家族成员可通过对线粒体膜和cytC释放的调节,调控细胞的凋亡。cytC可通过对凋亡信号的转导和放大作用调控细胞凋亡,cytC与EMT的相关研究国内还鲜见报道。Survivin是一种关键性的凋亡抑制蛋白,是近年研究的热点,主要通过直接或间接与caspase相互作用来抑制细胞凋亡。Survivin可能通过抑制cytC的释放在线粒体水平参与抗凋亡。研究表明,Survivin在异位内膜组织的表达显著高于在位内膜,认为其促进了EMT的发生和侵袭性。Ueda等研究发现Survivin在异位病变组织和EMT的在位内膜组织中表达比正常子宫内膜组织高,提示Survivin上调与EMT的浸润和生长呈正相关。目前Survivin与EMT相关的中医药研究文献报道极少,尚处于探索阶段。EMT属于中医“痛经”、“癥瘕”、“不孕症”等病证范畴。瘀血内阻是产生EMT症状和体征的关键,湿热瘀结也是EMT的主要病机之一,是病情缠绵难愈,反复发作的病理基础。内异康复栓以“湿热瘀结”立论,处方由大血藤、丹参、三棱、土鳖虫等组成,功效清湿化瘀、行气止痛、消癥散结。由于EMT的病变主要在盆腔局部,栓剂直肠给药可使药物“直达病所”,避免了肝脏的“首过效应”,可获得理想的治疗效果。本实验结果显示内异康复栓高、低剂量组均显著增加模型大鼠异位内膜cytC的表达并降低Survivin的表达;内异