维生素C的测定

维生素C的测定一、实验目的与要求掌握荧光法测定食品中维生素C含量的方法。了解分子荧光分析法的基本原理。了解F96型荧光分光光度计的使用方法。二原理多数分子在常温下处在基态最低振动能级，产生荧光的原因是荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁至较高能级的第一电子激发态或第二电子激发态，处于激发态的分子，通过无辐射去活，将多余的能量转移给其他分子或激发态分子内振动或转动能级后，回至第一激发态的最低振动能级，然后再以发射辐射的形式去活，跃迁回至基态各振动能级，发射出荧光。荧光是物质吸收光的能量后产生的，因此任何荧光物质都具有两种光谱：激发光谱和发射光谱。维生素C又称抗坏血酸。抗坏血酸在氧化剂存在下，被氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与邻苯二胺作用生成荧光化合物，此荧光化合物的激发波长是350nm，荧光波长（即发射波长）为433nm，其荧光强度与抗坏血酸浓度成正比。若样品中含丙酮酸，它也能与邻苯二胺生成一种荧光化合物，干扰样品中抗坏血酸的测定。在样品中加入硼酸后，硼酸与脱氢抗坏血酸形成的螯合物不能与邻苯二胺生成荧光化合物，而硼酸与丙酮酸并不作用，丙酮酸仍可以发生上述反应。因此，在测量时，取相同的样品两份，其中一份样品加入硼酸，测出的荧光强度作为背景的荧光读数。由另一份样品不加硼酸，样品的荧光读数减去背景的荧光读数后，再与抗坏血酸标准样品的荧光读数相比较，即可计算出样品中抗坏血酸的含量。操作步骤三、仪器与试剂仪器：组织捣碎机，离心机，荧光分光光度计（F-2500）试剂：①百里酚蓝指示剂（麝香草酚蓝）：称0.1g百里酚蓝，加0.02mol?L-1氢氧化钠溶液10.75mL溶解，用水稀释至200mL。变色范围pH1.2（红）〜2.8（黄）；乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L;硼一一乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL（使用前配制）；邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中（使用前配制）；偏磷酸一冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中；偏磷酸一冰醋一酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015mol?L-1硫酸稀释至500mL;抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷■——冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，此标准溶液浓度为每毫升相当于1mg的抗坏血酸（每周新鲜配制）；吸取上述溶液5mL,再用偏磷酸一冰醋酸溶液定容至50mL,此溶液每毫升相当于0.1mg的抗坏血酸标准溶液（每天新鲜配制）；漠；活性碳：取50g活性碳加入250mL10%盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，再于110〜120°C烘干备用。四、实验步骤仪器操作条件2绘制标准曲线：（1） 将制备好的50mL标准溶液（含抗坏血酸0.1mg/mL）倒入三角瓶中，再往三角瓶中加入2〜3滴溴（在通风橱内进行），摇匀变微黄色后，通空气将漠排净，使溶液恢复为无色，若用活性炭为氧化剂，加1〜2g活性炭摇匀1分钟，过滤。（2） 取2只50mL容量瓶，各加入刚处理过的溶液1.0mL，其中一只容量瓶中再加入20mL乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准溶液。另一只容量瓶中加入20mL硼•——乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准空白溶液。取5支带塞的刻度试管，一支试管中加入2.0mL标准空白溶液，另4支试管中各吸0.5、1.0、1.5、2.0mL标准溶液，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。避光反应：在避光的环境中，迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，加塞，振摇1〜2分钟，于暗处放置35分钟。荧光测定：选择上述最佳的仪器条件，记录标准溶液各浓度的荧光强度和标准空白溶液的荧光强度，标准溶液荧光强度减去标准空白溶液荧光强度计算相对荧光强度。3.样品测定：(1)样品处理：称取均匀样品10g(视样品中抗坏血酸含量而定，其含量约在1mg左右)，先取少量样品加入1滴百里酚蓝，若显红色(pH=1.2)，即用偏磷•——冰醋酸溶液定容至100mL，若显黄色(pH=2.8),即用偏磷•——冰醋酸一酸溶液定容至100mL，定容后过滤备用。⑵氧化处理：将全部滤液转入三角瓶中加入1〜2g活性炭振摇1〜2分钟，过滤。或在通风橱中加2〜3滴溴，以下操作与绘制标准曲线同。取2只50mL容量瓶，各加入5.0mL经氧化处理的样液，再向其中一只加入20mL乙酸钠溶液，用水稀释至50mL作为样品溶液；另一只加入20mL硼酸一乙酸钠溶液，用水稀释至刻度，作为样品空白溶液。取2支带塞的刻度试管，1支试管中加2.0mL样品溶液为样液，另一根试管中加入2.0mL样品空白溶液作为空白，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。⑸避光加邻苯二胺，以下操作与绘制标准曲线(4)、(5)部分同样进行，得出样品的相对荧光强度。四.数据处理记录数