聚蔗糖-泛影葡胺分离液在鲫外周血中的应用

聚蔗糖-泛影葡胺分离液在鲫外周血中的应用

随着海洋动物疾病免疫控制的发展，鱼类免疫机制的研究越来越受到重视。鱼类的免疫系统虽不及哺乳动物发达,但其外周血淋巴细胞也是分成T细胞和B细胞两大类,淋巴细胞经诱导后转化为淋巴母细胞,随着形态的变化,合成并释放出多种细胞因子和抗体等效应分子以调控免疫应答的产生。要研究鱼类的免疫机制,首先必须从血液或者其他淋巴组织或器官中分离提取足够数量、高纯度的有活性的淋巴细胞。分离鱼类淋巴细胞的方法很多,目前比较常见的是聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)分层液密度梯度离心法,该法简单易行,所分离的淋巴细胞的纯度、得率和活力都比较高。本试验即采用此法分离鲫淋巴细胞。1材料和方法1.1高龙饲料水泥池鲫鱼(Carassiusauratus),购于信阳南湾水库水产站,体重300~350g,体长21~26cm,无病无伤,活泼健康。于2m×2m×1m水泥池中饲养一周,每天早晚各投喂一次颗粒饲料(武汉高龙饲料有限公司产品),视水质情况换水。确认鱼体健康正常后用于试验。1.2细胞分离液的配制首先通过体积称量法算出76%泛影葡胺的密度,然后将淋巴细胞分离液和泛影葡胺按照不同体积比混合在一起,配制成密度分别为1.077,1.080,1.083,1.085,1.087,1.090g/mL的淋巴细胞分层液。1.3外周血活检密度的确定鲫外周血淋巴细胞的分离参照Verburg-vanKemenade等的方法进行,并稍加改进。即取鲫数尾,干抹布擦干体表,0.1%KMnO4体表消毒后再用75%酒精棉球擦洗,置于超净工作台的解剖盘上,用准备有肝素抗凝剂的注射器,从鲫尾动脉中采取外周血,立即取一滴用于淋巴细胞计数,其余用等体积的洗液稀释一倍,取密度分别为1.077,1.080,1.083,1.085,1.087和1.090g/mL的淋巴细胞分层液各2mL,分别置于10mL已灭菌塑料离心管中,用移液器取稀释血液4mL,沿管壁缓缓地叠加到淋巴细胞分层液界面上,注意不要破坏分层液界面。用高速冷冻离心机(SIGMA公司产品)水平转头于20℃,800g,离心20min,用毛细吸管插入分层液与血浆交界部位浑浊的灰白层,沿管壁轻轻吸出灰白层淋巴细胞富集层,放入新的离心管中,用5倍体积洗液重悬洗涤,于4℃,600g,离心10min,再用洗液洗涤2次,弃上清,定量加入RPMI-1640完全培养液2mL,吹打均匀,即成鲫外周血淋巴细胞悬液。1.4细胞计数1.4.1外周血中细胞计数tf取10μL鲫外周血加入2mL鱼用血细胞稀释液中,充分混匀,取一滴加入血球计数板上,显微镜下计数4个大方格内的淋巴细胞总数,按公式:淋巴细胞密度(个/mL)=4个大方格内的淋巴细胞总数/4×104×200(稀释倍数)计算外周血中淋巴细胞数。1.4.2细胞密度和回收率取1滴细胞悬液与1滴0.2%台盼蓝染液混合均匀,5min后,加入血球计数板上,显微镜下计数4个大方格内的淋巴细胞总数,按公式:淋巴细胞密度(个/mL)=4个大方格内的淋巴细胞总数/4×104×2(稀释倍数)进行计算。淋巴细胞回收率=[所得细胞悬液体积(mL)×悬液中淋巴细胞密度(个/mL)]/[原血液体积(mL)×原血液中淋巴细胞密度(个/mL)]×100%。同时进行细胞活力检测,死细胞可被染成蓝色,活细胞不着色,按公式:活细胞百分率=活细胞数/总细胞数×100%,计数200个淋巴细胞,计算出活细胞的百分率。2结果与分析2.1细胞回收率及细胞富集层通过比较不同密度淋巴细胞分层液的分离结果,发现密度为1.085g/mL的分层液可有效分离出鲫外周血淋巴细胞(表1),离心管内液体明显分成4层,最上层很厚,鲜红色,为血浆层;第2层较薄,呈灰白色膜状,即为淋巴细胞富集层;第3层很厚,无色透明,为细胞分层液层;最下层为明显的压集红细胞层,其上有一很薄的白膜层。经过9次试验重复,淋巴细胞回收率为76.21%~93.79%,平均为85.11%;每毫升外周血可获4.42×106~5.44×106个淋巴细胞,平均为4.88×106个。同时,通过台盼蓝拒染色法检查所分离细胞的存活率,发现9次试验重复的细胞存活率均≥96%(表2)。用密度低于1.085g/mL的淋巴细胞分层液进行淋巴细胞分离,发现淋巴细胞富集层不明显,有时看不到淋巴细胞富集层,镜检淋巴细胞数量也很低;而用高于1.085g/mL的淋巴细胞分层液分离淋巴细胞时,发现淋巴细胞富集层较明显,镜检淋巴细胞数量也较多,但红细胞数量也相应增多,占有相当比例。2.2红细胞富集层分别观察血浆层、淋巴细胞富集层、细胞分层液层和红细胞层所作的涂片,发现血浆层中含有大量血栓细胞;淋巴细胞富集层中含大量的淋巴细胞、少部分的单核细胞、极少部分的血栓细胞和个别的红细胞,经观察统计,淋巴细胞占82%~91%,平均为86%,单核细胞占9%~18%,平均为14%;分离液层中无任何细胞;压积的红细胞层上为粒细胞层,呈一层很薄的白膜,取样较难,易将红细胞吸入。3分离细胞的细胞为了研究鱼类淋巴细胞的各项功能,首先必须从鱼类外周血或其他组织器官中最大限度地分离出有生命力的淋巴细胞。目前,淋巴细胞分离技术主要有:稀释血液离心法、血浆凝胶法、Ficoll-hypaque分层液密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法。具体选择何种细胞分离技术,首先要看该技术所分离细胞的纯度、得率和活力是否能够满足研究需要,同时又要看该技术是否简单易行。由于不同种属的动物其淋巴细胞的大小、密度、表面电荷和粘附能力等均存在着差异,因此,在选择淋巴细胞分离液时就要注意这些因素的影响,选择不同密度和特性的分离液。密度为1.077g/mL的细胞分离液(Ficoll-hypaque)是市售的标准淋巴细胞分离液,可有效地分离人的淋巴细胞,但用来分离鲫的淋巴细胞效果较差,为此本研究通过加入不同量的76%泛影葡胺以调节密度,发现在20℃,800g(2310r/min)离心20min的条件下,1.085g/mL的分离液可有效地分离鲫外周血淋巴细胞。与丰培金等报道的鲤(CyprinuscarpioL.)白细胞分离结果基本一致。但陈全震等认为,自配的相对体积质量为1.080~1.085g/mL的Ficoll-Urografin分层液在4000r/min30~60min的条件下,可将草鱼(Ctenopharyngodonidella)外周血中淋巴细胞100%地分离出来。二者结果显然存在差别,原因可能是由于种属不同、环境温度不同、离心力和离心时间不同及其他一些难以预测的因素等造成分离结果的很大差别。虽然细胞分离液的密度是影响淋巴细胞有效分离的关键因素,但其他一些因素的影响也是不可忽视的。其中采集足量的外周血液是收集大量淋巴细胞的前提条件,另外离心力、离心时间、环境温度、个体差异及血液黏稠度都会影响分离的淋巴细胞数量和纯度。若加大离心力和延长离心时间,虽然有时可以提高淋巴细胞回收率,但势必会大大降低淋巴细胞的存活率,使红细胞的脆性发生改变,造成溶血现象。一般采用600~1000g(相当于2000~2500r/min)离心力、20~25min的离心时间。环境温度过高也会严重影响淋巴细胞存活率,过低则会影响细胞分离液的分离效果,如Ficoll-hypaque分层液即要求在整个分离过程中,温度应始终控制在18~28℃之间,以20℃左右最好,否则将影响分离质量。血液自身黏稠度很大,为提高淋巴细胞分离效果,分离前将血液进行2