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运用多环芳烃的联合效应预测亚致死毒性的浓度环境与分子毒理学实验室，北卡罗莱纳州立大学摘要:多环芳烃通常以多种化合物复杂的组合对环境造成污染。模型的方法提供了一种评价这些多环芳烃混合物毒性的途径。在本研究中，我们测试了四种多环芳烃联合作用的假设：苯，芘，荧蒽和萘。甲壳类大型水蚤暴露在亚急性中的生长速率能够通过一个计算浓度加和的数学算法进行准确预测，这一计算方法根据假设是这些多环芳烃对于水蚤生长影响的模式相同。对于四种多环芳烃各自的毒性的评价证实这些化合物引起了水蚤在小于致死浓度的浓度下生长迟缓的共同作用，运用由实验得出的各个化合物的毒性参数得出了四种多环芳烃混合物毒性的模型。这些混合物是根据已报导的环境中浓度和同等毒物浓度确定的。四种物质140多种组合对于水蚤生长速率的影响由实验测定并且与预测模型进行比较。浓度加和模型包括预测这些多环芳烃混合物联合毒性和实验数据，这一模型能够很好的由一个根据单个物质联合毒性反应得替代模型进行代表。混合物在环境中的相对应的浓度的预测和实验已经被证明了是对于水蚤的生长速率没有影响的。结果表明了多环芳烃能够通过多种作用机制对于水蚤引起的毒性并且论证了一个合适的用来评价这些混合物毒性的模型。关键词：危害评价；风险评价；响应加和；协同反应；混合物毒性1.引言多环芳烃通过自然和人类活动不断地进入环境中,自然和人类的活动包括化石燃料的不完全燃烧，森林火灾以及火山活动(Baek等人，1991；ATSDR,1995；Howsam和Jones,1998)。多环芳烃也会通过工业和水处理工厂，渗透和意外泄漏而进入水生系统(ATSDR,1995)。这些化学物质在淡水湖，溪流和湖泊中无处不在。美国环境保护部门根据清洁水导则将126种有毒物质中定为“优先有毒污染物”，其中16中是多环芳烃。然而，由于多环芳烃的组成，它们从来不是单独的化合物，而是在环境中以混合物而存在(ATSDR,1995)。应用预测模型评价暴露在多环芳烃混合物的影响，此预测模型的发展和确认能够提高对这些有毒物质的风险评价。一种已经用于预测水体环境中已经定义的混合物毒性的方法是浓度累加法(Niederlehner等人，1998；Altenburger,2000;Cleuvers,2003)。浓度叠加的数学表达为：£C-=1 （1）ECxi=1 iC是指由n种化合物构成的混合物中的第i中组分的浓度，x是指对整个混合物i的影响。ECx是指单独暴露下能够引起和混合物（X）相同的反应的第i中组分的i浓度。浓度累加模型的假设是以化合物所构成的混合物通过相同的反应模型产生效应为根据的。等毒性的方法是根据浓度累加是进一步假设混合物中的各个化合物的“浓度---反应”曲线两两平行。这一方法有效地将化合物标准化，通过运用EC50S与参考值进行比较。公式的数学表示为：TOC\o"1-5"\h\zn EC50\o"CurrentDocument"C=£CX严 （2）effiEC50i=1 iC是指相对于参照化合物r得出的混合物的有效浓度，C代表混合物中各个组eff i分的浓度，EC50i代表第i个化合物的EC50。EC50r是指参照化合物的EC50。这一方法广泛用于评价像二恶英类之类的混合物，参照化合物是TCDD。等毒性的方法也将多环芳烃应用于应用于致癌研究。然而，能否应用于多环芳烃混合物在水体中的毒性是未知的。作为替代方法预测混合物反应是根据各个化合物联合反应的参数确定，数学表达为：R=1-Ft1（1-R） （3）mix ii=1R是混合物总得反应，Ri是化合物i的反应。这一方法是假定单独的物质混合mix并减去其中重叠的部分。在本方法中，假设的依据是各个组分引起通过不同机制而引起反应。在本研究中，我们应用水体中生长迅猛的水蚤评价了四种多环芳烃单独和混合毒性作用。从美国最近对于淡水河流的调查中获得了应用价值。我们的实验决定于这四种化合物的混合物能否在相应的环境浓度下影响水蚤的生长速率。我们也评估了与这些多环芳烃等毒性的混合物，由此与浓度累加模型和多环芳烃联合毒性比较。对于所有混合物，我们假设这些多环芳烃混合物的联合反应能够通过浓度加和的方法模型化。2.材料和方法2.1背景实验中所用的水蚤已经在北卡罗莱纳州立大学培养了十年，培养条件与之前研究中描述相同（Baldwin和Leblanc,1994）。水蚤在1L的烧杯中进行培养，每只烧杯中水蚤的密度是40只，一周更换三次容器。每天喂两次食，每次喂食量为1.4x108个绿澡细胞，羊角月牙藻和4mg干重的鱼食的组织匀浆。在室内光照：黑暗是16:9的环境中进行培养，光照温度为20oc。水蚤在培养基中在室温条件和恒定光照下进行培养。所有实验用水蚤年龄不低于24h。2．2单个多环芳烃暴露四种多环芳烃都是优先污染物，并且对于水蚤生长速率的影响单独测定。每种多环芳烃的纯度在99.0%以上。每个实验由50组多环芳烃的对照浓度以及10组控制浓度构成。将多环芳烃溶于乙醇介质中。每隔一日更换溶液。所有的处理，包括对控制组的处理乙醇含量<0.01%，并且在所给定的实验中乙醇含量是不变的。每个浓度有一只水蚤为下一最高浓度做准备，最高浓度为90%（荧蒽，菲和萘）或95％的最高浓度（芘）。每次实验的最高浓度根据急性毒性实验，并选择在暴露的7天中最低致死浓度。每天，要通过显微镜检查烧杯中水蚤的棚外骨骼。骨骼长度用目镜测微计从甲壳顶部测量至脊椎尾部。对于每一个水蚤，将前四只测定的骨骼长度与换壳次数绘制直线，并线性回归。直线的斜率代表水蚤的生长速率。之前的研究对这种测量水蚤生长速率的计算方法有详细的叙述。对照组水蚤的平均生长速率作为正常的生长速率，实验组水蚤的生长速率以百分比表达，由于暴露在多环芳烃中，实验组的生长速率减少。实验数据运用软件绘制，得到S型浓度—反应曲线，格式如下：p_ 100 ⑷_R— T竽IpR是指生长速率的减少，以百分比表示。C是多环芳烃的浓度。EC50和p是浓度---反应曲线的参数，分别代表引起50%反应的浓度和曲线的参数。这些参数在混合物模型中也使用。

2.3多环芳烃混合物的暴露混合物暴露与多环芳烃单独暴露的实验设计类似。每个暴露都要基于一个给定的多环芳烃浓度，这一给定的浓度被认为是对应的暴露的基浓度。多环芳烃相对于混合物的基浓度见表1。将混合物的稀释并配制用于实验组，每个实验组浓度是上一个浓度最高组的90%。所有实验组多环芳烃浓度比率相同。同样地，一只水蚤在每一个实验组中暴露。与环境相关的混合物是根据美国最近的有价值的报道所确定。根据调查结果，一种混合物由中位数相同的多环芳烃构成，另一种则是由最大浓度的各个多环芳烃构成。进行进一步的混合物实验是为了对于等毒性模型以及单独的联合反应模型能够进行准确评价。一组实验与环境基准混合物的设计相同，应用各个多环芳烃EC05浓度做为基础浓度（见表1）。实验组浓度设定为下一个实验组最高浓度的95%。其它组实验检测了一系列在等毒性浓度条件下由四种多环芳烃构成的实验组。多环芳烃混合物的等毒性实验组浓度从他们的EC005—EC15。此实验中10只水蚤在实验组中单独暴露，实验组与对照组之间应用T检验法进行比较。2.4混合物模型预测多种混合物的影响根据方程（2）和（4），并由此产生如下的公式：mix1007mix10075）1C iEC50Rmix是混合物的响应。Ci和EC50i是浓度，EC50相对于一个给定多环芳烃,p四种多环芳烃浓度一反应曲线的平均参数。公式（2）中的Ceff和EC50r代人公式（4）中。因为对于多环芳烃混合物来说不需要包含一个作为参照的多环芳烃，所以将EC50r去掉。通过公式（5）等效毒性法和公式（1）的迭代累加来计算混合物的毒性的相加模型。混合物的毒性模型也根据公式（3）单独联合毒性反应确定。模型预测和实验结果是通过测定系数进行比较。3.结果3.1多环芳烃化合物单独暴露针对每个多环芳烃物质在非致死浓度下单独暴露的结果是生长速率减缓（见图1）。各个多环芳烃在暴露条件下EC50和参数p的值见表2。芘和荧在近似的浓度范围，即~10-100ug/L，生长速率减缓。同样地，菲减缓生长对应浓度为~40-400ug/L，萘对于减缓生长的影响不显著，能够引起影响的浓度大于1000ug/L。3.2混合物通过浓度加和模型的方法，能够得出这些多环芳烃混合物根据其在环境中的比率所构成的混合物的影响（图2A，实线代表毒性当量，散点代表浓度加和）。通过模型表明，多环芳烃的浓度选在其环境浓度的中位数浓度，不会对水蚤的生长产生影响。也表明了多环芳烃浓度在接近环境中位数浓度的100倍时，对水蚤生长产生显著的不利影响。模型进一步表明了多环芳烃浓度在其环境中位数浓度的100倍到1000倍的范围内，水蚤的生长速率会由于混合物的等级而逐渐降低。对这些多环芳烃混合物影响水蚤生长速率的直接评价与浓度加和模型的预测结果一致（图2A）。等毒性模型的测定系数（Q）是0.73，这表明了该模型中包括了73%水蚤暴露下所测量的生长速率减少的变化值。一般浓度加和模型产生的预测与应用等毒性法测定的值相同（r2=0.77）。多环芳烃混合物的各个组分比率等同于化合物在环境中最大的比率。等毒性模型和浓度加和模型都表明了，多环芳烃浓度是环境最大浓度时不会对水蚤的生长速率产生不利影响。然而，在浓度达到5倍时，影响会变得显著（见表1）。模型近一步表明了当高于5倍浓度时，水蚤的生长速率会对着混合物浓度的升高而降低。对于多环芳烃混合物对水蚤生长速率的直接测定表明浓度加和模型对此混合物的毒性测定值偏高（见图2B）。由浓度加和模型所测定的混合物响应阈值是其3倍（基本浓度的15倍）。此外，等毒性的测定系数（0.46）和浓度加和的测定系数（0.53）表明了，应用这组数据使得模型的预测力下降。应用独立的联合反应（公式3）模型对于混合物试剂重新测定是为了证明，这一方法是否适用于多环芳烃混合物。当混合物试剂浓度比率由多环芳烃在环境中位数的浓度构成，单独联合反应模型与浓度加和模型所得结果较为接近（分别是r2=0.71和r2=0.77,见图2A）。单独联合反应模型比预测模型得出r2值高（单独联合反应模型r2=0.77，等毒性模型r2=0.46,浓度加和模型r2=0.53，见图2B）。这些混合物实验的结果表明多环芳烃联合毒性较为合适的模型是单独联合模型，而不是浓度加和模型。为了证明单独联合模型适用于多环芳烃混合物毒性，在混合物基本浓度是其各个组分的EC05的浓度下，对于多环芳烃混合物对生长速率影响进行实验测定并模型化。通过浓度加和模型（包括等毒性模型和一般浓度加和模型）和单独联合模型将混合物稀释5倍直接测定并模型化（见图3A）。单独联合模型相对于加和模型显然更为准确（单独联合模型r2=0.87，等毒性模型r2=0.59,—般浓度加和模型r2=0.54。见图3A）。最后，实验测定了7组浓度从各自EC005到EC15范围内的多环芳烃混合物的等毒性混合物，并对其毒性进行评价（见图3B）。同样地，单独联合反应模型测定水蚤生长速率相比与两种加和模型来说更为准确。4.讨论假设对四种多环芳烃的评价模型相同，我们假设浓度加和模型能够准确地预测混合物暴露对于水蚤生长速率的影响。结果是，相对于实验结果两种加和模型对反应值预测过高。另外一种单独联合反应模型能够更为准确地预测混合物毒性。尽管3种模型的不同，但是其预测值之间并没用显著差异，它们都能够针对多环芳烃混合物得到恰当的毒性预测值。对于等毒性法与实验结果的反应预测差异的一种解释是，这四种多环芳烃与相同反应的模式的假设不符。多环芳烃能够通过多种机制产生毒性。包括非极性麻醉，形成加合物，产生活性氧自由基和干扰荷尔蒙。模型可能由于不同的多环芳烃是通过不同的机制引起反应而受到一些影响。例如，在果蝇B11的细胞中，荧是一个弱的蜕皮激素受体拮抗剂。蜕皮激素受体拮抗剂能够干扰蜕皮频率，这就使得生长速率减缓，这个结果与我们实验测定一致。已经在C1.8细胞蜕皮激素受体和ECR基因构建中证明，多环芳烃芘能够修改蜕皮激素的活性，以激活蜕皮激素受体。作者总结这些影响是独立的。基于这些观察，芘会通过一个不同于荧的机制干扰蜕皮激素信号并影响果蝇生长速率。我们注意到，菲和芘都会造成水蚤蜕皮频率下降；而萘和萤蒽不会。因此，菲和芘会通过蜕皮的途径影响生长速率，这不同于萘和萤蒽。多环芳烃对生长速率的影响能够解释单独联合模型的准确性。一种毒性单元的方法已经成功应用于预测沉积物中多种水生生物体多环芳烃混合物的准确毒性。浓度加和模型通过毒性单元法预测多环芳烃混合物对于三种无脊椎动物的影响，得到的结论是多环芳烃混合物之间的作用是协同的。Swartz等人（1995）指出对于端足目动物，测定的混合物毒性和应用毒性单元法并由毒性模型得到的结果无显著性差异。然而，同一模型又存在轻微的不太显著的差异，即对于激活下的多环芳烃的预测值过高。所有的预测都与我们的测定结果一致，浓度加和的偏差不大，并且能够对于多环芳烃对于生物体