叶甲科植物酯酶同工酶的研究

叶甲科植物酯酶同工酶的研究

自20世纪70年代以来，生物化学研究的手段逐渐传播到几个学术领域，尤其是工作酶的研究，成为物种分化、物种鉴定和系统分类的重要手段（黄原等，1990；李少文等，1987；彭统序，1986）。酯酶同工酶(esteraseisozyme)是能水解酯键的一组酶,在生物体内广泛存在。许多实验证明:它在种系的鉴定中具有很重要的参考价值(郭晓霞等,2000)。通过物种同工酶的研究,可以由生化特征推测物种在基因水平的差异,进而推测其血缘关系和进化地位,并推测它们的系统分类。叶甲科属鞘翅目叶甲总科,是一种重要的农业害虫,本文用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳对叶甲科3亚科13种叶甲的酯酶同工酶进行了比较研究,探讨以酯酶同工酶来研究叶甲科与亚科的系统分类,与形态学确定的系统分类之间的差异,及其在叶甲科系统分类研究中应用的可行性(聂传朋等,2005;胡红英等,2006)。1材料和方法1.1来自来源1.2酶源及电泳检测将野外采集的叶甲置于预冷的研钵中,加适量提取液(20%蔗糖)及少量石英砂,样品研磨完后,6000r/min离心10min,贮于4℃下待用。点样时吸取上清液作为酶源。采用DYCZ-24D型双垂直板电泳槽和ECP3000型三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)。分离胶浓度7.5%,pH为8;浓缩胶浓度3%,pH为6.7;电极缓冲液为Tris-Gly,pH为8.3;胶板大小为125mm×100mm×1.5mm。在4℃冰箱中电泳5h(浓缩胶为110V,分离胶为180V)。酶活性染色参照胡能书(胡能书,1985)的方法。胶板经染色固定后,测定各条酶带的相对迁移率(relativemobility)。1.3多次电泳时的移动距离各酶带的相对迁移率(Rm)是以指示剂溴酚兰在每次电泳时的移动距离(Xf)为标准计算的。若每一条酶带从负极向正极移动的距离为Xi,则该酶带的相对迁移率:Rm=Xi/Xf。1.4基于类间平均法的聚类分析本文采用系统聚类法,首先将每个样本看成一类,计算它们之间的相似系数和相异性系数。本文采用欧氏距离系数(Euclideandistance),运用类间平均法进行聚类分析。具体方法是选择最为相近的两个样本归为一新类,然后计算新类与其它样本之间的相似性,再选择最相似的两个样本归为一类,直到所有样本都归类为止。系统聚类的具体方法很多,其差异在于类与类之间采用何种相似(或相异)系数以及如何进行并类(白义等,2006)。2结果和分析2.1实验菌株的筛选聂传朋证明叶甲科昆虫其酯酶同工酶的性别差异小于种间差异(聂传朋,2004),所以本实验在设计中只是选用采集的标本进行实验,未作性别的鉴别。实验重复3次,共6块胶板,重复性比较好。选取比较好的胶板可以看出酶谱分成4个泳动区,即第1～4条带泳动区、第5～8条带泳动区、第9～13条带泳动区以及第14～17条带泳动区。相应地可以推测叶甲科昆虫酯酶同工酶可能由4个基因位点控制,每个基因位点可能由3～5个等位基因控制。2.2形态特征分类从表2可以看出,所有样品都具有Rm为0.84的带,可能这条带代表此科的特点。依形态特征进行分类,以上13种叶甲包括3个亚科,从表3可以看出,它们的相似性也比较高,并且各亚科均有代表性的酶带,叶甲亚科具有0.51、0.57等条带,跳甲亚科具有0.12、0.24、0.45等条带,萤叶甲亚科具有0.09、0.87两条带。2.3叶甲属类昆虫聚类分析结果本文根据区带之间同源性,将测得的各种酶带的迁移率转化为0或1数据(此处有带记为1,无带记作0),直接输入软件SPSS(10.0版本)的数据录入界面。采用欧氏距离系数,运用类间平均法进行聚类分析。结果如下。从图2可以看出,13种叶甲明显聚为4类,其中前两类为萤叶甲亚科,后面的分别是跳甲亚科和叶甲亚科。总体来看,相同的亚科聚为一类,并且亚科内各属也聚为一类。亚科以下阶元的聚类结果和形态学分类相一致,说明以酯酶同工酶作为研究手段,进行叶甲类昆虫亚科以下阶元的分类是可行的,同时也说明了它们酯酶同工酶酶谱的差异和其分类地位是一致的。从聚类结果看,跳甲亚科和叶甲亚科先聚为一类,然后再和萤叶甲亚科聚为一类。3酯酶同工酶的结构和分类酯酶同工酶在动物体内不仅含量丰富,而且组成复杂,这组酶既受DNA不同位点的控制,同时又受到同一位点不同等位基因的控制,因而表现的酶谱很复杂(韩雅莉等,1999)。从本项研究看,13种叶甲的酯酶同工酶酶谱及聚类分析结果分为4类,与形态特征分类结果相一致,郭晓霞等指出在低级阶元(亚科以下水平)的分类中,酯酶同工酶位点独立进化的时间相对较短,加之阶元内类群基本属于同一生态型,其酶谱的差异和相似是真实的,尤其对于那些遗传结构上分化较大而外部形态变化不大的种类之间,酯酶同工酶具有鉴别性意义,酯酶同工酶具有多态性在昆虫分类学中有一定的应用价值(郭晓霞等,2000),因此笔者认为叶甲科昆虫在亚科以下阶元的系统分类中酯酶同工酶可以作为一种分类学研究手段。从3亚科的聚类结果看,跳甲亚科和叶甲亚科先聚为一类,然后再和萤叶甲亚科聚为一类。Brian,DF通过研究留有叶甲蚕食痕迹的植物叶子化石,推测叶甲总科的进化史,显示在中生代石炭纪中期形成了叶甲亚科分支与萤叶甲亚科和跳甲亚科分支,在新生代中期萤叶甲亚科和跳甲亚科分支分化为两个独立发展的分支(Brian,DF,1998),笔者的研究结果与前人不符。研究结果出现差异的原因可能是:萤叶甲亚科和跳甲亚科分化后,其酯酶同工酶的编码基因进化速率比较快,基因变异较大;而跳甲亚科酯酶同工酶的编码基因进化速率比较慢,且包含有较多的祖先遗传信息,从而导致在酯酶酶谱表现上跳甲亚科和叶甲亚科的亲缘关系比较近这一