黄酮类化合物的电化学分析方法研究进展

黄酮类化合物的电化学分析方法研究进展

黄酮类化合物是大多数植物身体中的一种存在的物质。大多数植物体内的糖结合在一起，一些以游离（格林威治）的形式存在。黄酮类化合物对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病等起着重要的作用。同时,黄酮类化合物生理活性多种多样,如槲皮素(quercetin)、芦丁(rutin)、葛根素(puerarin)等具有扩冠作用,水飞蓟宾(siybin)具有保肝作用等,因此引起了人们的广泛研究。近10年来,黄酮类化合物的研究倾向于其药用及保健价值的开发,涉及到提取、分离、纯化的研究。黄酮含量测定在生产原料的品质鉴定、制剂工艺的评价及制剂的质量控制等方面有非常重要的意义。目前黄酮类成分含量测定方法主要有:光谱分析法、色谱分析法、电化学分析法等。下面介绍电化学分析法在测定黄酮含量中的应用。1黄酮化合物的测定库仑分析法(coulometry)是1939年L.Szebelledy和Z.Somoghi首先提出的,其理论基础是法拉第定律。库仑分析法是在电解分析法的基础上发展起来的,通过测量被测物质在100%电流效率下电解所消耗的电量进行定量分析。库仑分析有两种形式:一种是恒电位库仑法,相当于控制电位电解;另一种是恒电流库仑法,也称库仑滴定法。黄酮定量分析采用库仑滴定法,常用的是溴库仑滴定法,利用黄酮结构中的酚羟基可与溴发生取代反应的原理对黄酮化合物进行定量。徐礼燊等曾系统地研究和报道了利用溴库仑滴定法测定黄酮、异黄酮、黄酮醇及双氢黄酮含量的方法,此法具有微量、快速、简便、准确及不需标准品等优点。张鹤鸣等报道了银杏提取物(EGb)中总黄酮的含量测定,以铂电极作指示电极,钨电极作参比电极,在含KBr的盐酸介质中,以KBrO3标准液为滴定剂,根据示波器荧光屏上荧光点的最大位移来指示滴定终点,由所消耗的KBrO3的量计算出(EGb)中总黄酮的含量(以芦丁计)。结果表明,本法与紫外分光光度法结果无显著性差别(99%置信度),且具有仪器简单,操作方便,测定快速淮确,可避免色素和其它杂质的干扰等特点。但需要注意的是底液盐酸的酸度,支持电解质KBr的用量以及滴定速度。胡卫兵等用乙醇回流法提取银杏叶中的总黄酮,用聚酰胺净化,以2mol/LHCl-1moL/LKBr-无水EtOH[V(HCl):V(KBr):V(EtOH)=3:3:2]混合液为电解液,死停法确定滴定终点,测定精密度RSD=1.25%,回收率为101.25%。Xu等用库伦滴定法测定了槐花中总黄酮,以含KBr-HCl的溶液作电解液,在阳极发生溴取代反应进行滴定,每分子芦丁与2分子溴反应,n=4。方法简便、快速、准确,可用于测定微量样品。徐礼燊等用库伦滴定法测定了三白草中总黄酮及金丝桃甙。余红等用库伦滴定法测定红花中总黄酮含量。王永宁等用库伦滴定法测定油菜花粉浸取液中黄酮含量,相对标准偏差小于5%,加标回收率94%～105%。2极谱法测定高良姜中的槲皮素极谱分析法(polarography)是在对试液进行电解时,根据极谱仪上得到的电流-电压曲线(极谱图)来确定待测组分及其含量,是一种特殊条件下的电解分析。它的特殊性表现在两个电极的面积差别很大,即采用一个面积很大的参比电极和一个面积很小的滴汞电极进行电解。孙仕萍等用单扫示波极谱法快速测定保健食品中的总黄酮含量,研究发现,在pH=8.6的Na2HPO4-KH2PO4底液中,峰电位Ep—0.74V(vs.SCE)处黄酮化合物产生灵敏的极谱还原波,以芦丁为对照品,该波的二阶导数峰电流(ip)与芦丁浓度在0.05～1.0mg/L范围内呈良好的直线关系,检出限为0.02mg/L。汪乃兴等采用差示脉冲极谱法测定高良姜中的槲皮素,灵敏度高,方法简便,毋须分离手续,可以在样品提取液中直接测定,结果良好。他们使用F-78型脉冲极谱仪(复旦大学电子仪器厂);工作电极为滴汞电极,对电极为玻态石墨电极,参比电极为AgAgCl电极;氮气除氧;取0.1mol/LpH6.4的(CH3)NOH-H3PO4缓冲液10mL,加入无水乙醇10mL,再加入一定量的样品溶液,通氮气5min。在-0.30～-0.70V区间记录脉冲极谱曲线,峰电位在-0.56V;其他实验条件为:电流灵敏度2×10-9A/mV,衰减1.0,补偿0,电压扫描速度5.0mV/s,脉冲间隔2.0s,脉冲振幅50mV;记录仪X轴灵敏度100mV/cm,Y轴灵敏度5mV/cm。在上述条件下,在3.57×10-5～9.19×10-5mol/L范围内,槲皮素浓度与极谱峰高有良好的线性关系,相对误差为+1.9%(四次结果平均值);标准加入法10次平行分析结果的变异系数为8.8%。奚洪民等也建立了示波极谱法测定银杏叶片中槲皮素含量的方法。他们以25%盐酸水解银杏叶片样品,用1.5mol/LNH4OAc-NH4OH(pH8.0)作为示波极谱底液,K2CrO4为滴定剂,以示波极谱图上出现切口指示滴定终点。徐礼燊等用PAR384B型(美国)极谱分析仪测定了葛根中的总黄酮。取1%(NH4)2SO1重蒸水溶液5.0mL,置于极谱池中,加入一定量标准品(或样品)乙醇溶液,通N2去氧4min,仪器参数:脉冲高度20mV;汞滴时间1s;扫描速度4mV/s;用阴极化扫描,原点电位—1.30V(vsAg/AgCl),记录导数脉冲极谱图。徐礼燊等还用微分脉冲极谱法测定了淫羊藿中总黄酮甙。张秀琴等用脉冲极谱测定法测定了中药青蒿中青蒿素。刘进邦等以K2CrO与槲皮素的直接氧化还原反应为基础,用pH8.0的1.5mol/LNH4Ac-NH4OH为示波极谱底液,根据示波极谱图上切口出现指示滴定终点,建立了测定药物制剂芦丁中总槲皮素含量的分析方法,方法简便、快速、准确,标准加入平均回收率为98.50%,RSD为0.41%。3线性关系和检出限、定量限高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)是一种离子域和带电离子在电场驱动下,在毛细管中按淌度和分配系数不同而进行分离的技术。被分离组分通过在线检测方式进行检测。HPCE以其高效快速、分辨率高、检测方便、进样量少、分离模式多的特点在生命科学、生物技术、药物和环境科学等领域有着广泛的应用。毛细管电泳按电泳迁移技术的不同分为:毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)、胶束电动毛细管色谱(micellaeletrokineticcapillarychromatography,MECC),毛细管等速电泳(capillaryisotachphoresis,CITP)、毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)五种类型。CZE、CGE、CITP及CIEF的分析对象是可解离的物质或带电的物质,而MECC除了可分离上述物质外,还能分析中性分子,适用于各类物质的分析。在黄酮类化合物的分析中,常用的是CZE和MECC,CITP很少使用。毛细管区带电泳(CZE)对样品的分离是由于各组分的淌度不同,从而形成一系列的区带。它相当于色谱法中的洗脱色谱。每个区带中是淌度相同的离子,但有可能是不同的物质。淌度与Q/Ma成正比(其中Q是离子的电荷,M是它的相对分子质量,指数a不是一个定数,与离子形状有关)。TaoBo等用熔融石英毛细管(58.5cm×50μmid),缓冲溶液为硼酸盐(pH=10.5),运行电压30kV,检测波长210nm,分离分析甘草根中的黄酮类化合物。孙莲等以含有体积分数为15%甲醇的10mmol/L的磷酸二氢钠-20mmol/L的硼砂溶液(pH8.62)为电泳缓冲液,采用压力进样方式,在25℃、20kV恒压下进行电泳分离,并在245nm波长处检测,分离测定了新疆不同地区、不同采集期、不同品种桑叶中芦丁、槲皮素的含量。结果表明,桑叶中的两种目标组分在12min内完全分离,且有良好的线性关系;芦丁和槲皮素的加样回收率分别为95.64%和99.36%,RSD分别为2.25%和1.79%(n=6)。吕元琦等建立了毛细管电泳法分析密蒙花中橙皮素、木犀草素和芹菜素的方法,研究了缓冲溶液pH和浓度、工作电压和进样时间以及β-CD的影响。在优化的条件下,3种物质在15min内得到良好分离。橙皮素、木犀草素和芹菜素的质量浓度分别在0.01～0.50mg/mL、0.02～0.70mg/mL、0.04～0.80mg/mL范围内与峰高呈良好线性关系,相关系数r分别为0.9992、0.9994和0.9984。3种物质基于迁移时间和峰高的相对标准偏差分别为1.3%、2.2%、2.6%和4.2%、3.7%、4.6%,检出限分别为3.5、4.5和5.0μg/mL。陈刚等以碳圆盘电极为检测电极,电极电位为0.90V(vs.SCE),在50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)中,使用长40cm熔融石英毛细管,用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和葛藤中葛根素、大豆甙元和芦丁含量。当分离电压为9kV,上述3组分在12min内完全分离。葛根素、大豆甙元和芦丁浓度与电泳峰电流分别在2.5×10-6～1.0×10-3,1.0×10-6～1.0×10-3和5.0×10-6～1.0×10-3mol/L范围内呈良好线性关系,检出限(S/N=3)分别为3.4×10-7,2.4×10-7和5.1×10-7mol/L。测定葛根素、大豆甙元和芦丁的混合标准溶液(n=7),峰高的相对标准偏差分别为2.71%,2.47%和4.21%。黄宝美等用Ag工作电极,检测电位为-0.6V,在20mmol/L硼砂、pH为9的优化介质条件下测定双氢青蒿素的含量,双氢青蒿素在4min左右出峰,在1～200mg/L范围内,峰高与浓度呈良好的线性关系,检出限为0.05mg/L。胶束毛细管电泳色谱(MECC)是在缓冲溶液中加入表面活性剂(十二烷基硫酸钠,SDS),当其浓度大于临界胶束浓度(CMC)时,形成有疏水内核、外部带电荷的胶束。在MECC中,被分析的物质在水相和胶束相中进行分配,溶质在水相中的迁移受电渗流和本身电泳迁移率的支配,而在胶束中的迁移是电渗流和胶束电迁移共同作用的结果,不同物质由于电迁移率及分配系数不同而被分离。Wang等用熔融石英毛细管(70.0cm×7μmid),0.2mol/LH3PO4,0.2mol/LSDS,乙晴,2-丙醇为缓冲溶液,检测波长254nm,用MECC测定EpimediumbrevicornumMaxim中的黄酮类物。邓永智等利用胶束毛细管色谱法分离中药银杏浸膏中的槲皮素、山萘素、异鼠李素三种黄酮;以SDS作表面活性剂,25mol/L硼砂/25mol/L磷酸二氢钾/1%(v/v)甲醇作电解液。佘佳红等用超临界流体萃取(SFE)-胶束电动毛细管色谱法测定银杏叶粗提物中槲皮素和山奈素的含量。MECC条件:空心熔融石英毛细管柱(55cmX75μm);缓冲液为磷酸二氢钠(25mmol/L)-硼砂(6.25mmol/L),pH8.5;SDS35mmol/L;检测波长254nm。MECC以肉桂酸为内标,在21.2～106.0μg/mL和20.0～100.0μg/mL范围内,槲皮素和山奈素均呈良好的线性关系和重现性。40、60和