荧光光谱在蛋白质研究中的应用

荧光光谱在蛋白质研究中的应用

一、基本原理

1、荧光的产生2、荧光的寿命：10-8―10-4s3、磷光的寿命：10-4―102s4、紫外的寿命：10-15s

紫外观察不到的过程，其它两种光谱可以观察到，如生色团及其环境的变化。5、由于它是发射光谱，所以灵敏度很高。6、磷光

二、仪器结构与主要光谱参量1、仪器结构2、主要光谱参量（1）吸收谱、荧光激发光谱、及荧光发射光谱

N-甲基咔唑在环己烷（2）荧光寿命去掉激发光后，分子的荧光强度(I0)将到1/e

I0所需要的时间，用表示，=1/k。如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，荧光寿命称为F,它与kF（荧光发射速率常数）成反比，F可以给出有关分子结构和动力学方面的信息。（3）量子产率表示物质发射荧光的效率，用表示。发射荧光分子在全部退激分子中所占比例。（4）荧光强度

F(I)=kP0C三、影响荧光的因素1、荧光与化合物的结构（1）跃迁类型*能发出较强的荧光，所以*是产生荧光的主要类型，主要是由于？。（2）共轭效应增大荧光物质的，从而使更多分子处于激发态，有利于荧光的发射。（3）刚性结构与共平面效应（4）取代基效应给电子基团如：-OH,-NH2,-OCH3,通过p-共轭，增强荧光.

吸电子基团如：-NO2,-COOH,降低荧光.（5）溶剂的影响

极性增加，发生红移。（1-氨基-8-萘磺酸酯），从辛醇乙二醇，红移且强度降低。（6）荧光淬灭因素

a.碰撞淬灭

b.能量转移

c.氧的淬灭作用

d.自淬灭

e.光照四、荧光在蛋白质研究中的应用1、蛋白质的内源荧光

主要来自Trp,Tyr,Phe,相对强度比为100:9:0.5.对于含有Trp,蛋白质主要表现Trp的特征,最大发射在320-350nm之间.如果只有Tyr和Phe,蛋白质主要表现Tyr的特征,最大发射波长在304nm之间.应用:反应计量比的测定反应动力学2.Ca2+对phospho-calsequestrin蛋白的影响

荧光增强且蓝移表明:Trp的微环境从极性表面转移到疏水内部.Appl.Phys.2000,B71,755-7633.Zn2+对氨基酰化酶的影响:

荧光降低且红移,Trp从疏水内部向外部移动.4.外源荧光的应用5、共振能量转移荧光共振能量（FRET）转移及应用辐射能量转移

荧光分子发射的荧光为某一物质分子吸收，前者（能量给予体,D）的荧光减弱或猝灭，后者（能量接受体,A）被激发：

D*D+ｈνA+ｈνA*

非辐射能量转移

根据作用机理的不同，非辐射能量转移分为共振能量转移和交换能量转移.

共振能量转移即荧光共振能量转移，机理是通过分子的偶极－偶极耦合作用进行能量转移，分子间有一定的距离。能量传递距离甚至可达7.0——10.0nm,也称为长距离能量转移.给予体和接受体的共振能量转移能级图能量转移效率

RO又叫Fröster半径（单位Å），在给予体和接受体分子间的距离等于RO时，能量转移和给予体的衰变几率相等.FDA为受体存在时供体的荧光强度;FD供体单独存在时的荧光强度RO值的计算

A1/2表示当有50％的能量转移效率（即激发态给予体的50％由荧光共振能量转移去活化）.荧光共振能量转移的基本条件给予体和接受体分子必须靠近（一般是1-10nm），即在远大于碰撞半径（r）的距离上发生。接受体的吸收光谱必须与给予体的荧光发射光谱重叠。给予体和接受体分子的偶极转移空间定向必须近似平行。能量转移效率与介质的粘度变化无关。最可能的荧光共振能量转移是单重态-单重态和三重态-单重态能量转移过程给予体和接受体对给予体接受体Ro(Å)荧光素四甲基罗丹明55IAEDANS1荧光素46EDANS2DABCYL333荧光素荧光素44BODIPYFL4BODIPYFL57BODIPYFL四甲基罗丹明

四甲基罗丹明CY5531-氯蒽苝411-氯蒽红荧烯381-氰蒽红荧烯84菲荧光素35*三苯胺叶绿素54*N,N-二甲胺9-甲蒽24**三重态-单重态能量转移；1.5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸;四甲基罗丹明碘乙酰胺菁染料Cy5

5-((((2-IODOACETYL)AMINO)ETHYL)AMINO)

NAPHTHALENE-1-SULFONICACID,IAEDANS

5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸

Msx(Msx-homeodomain)Themsxhomeodomainproteinisadownstreamtranscriptionfactorofthebonemorphogeneticprotein(BMP)-4signalandakeyregulatorforneuraltissuedifferentiation.

接受体分子是,标记蛋白质中6，10，27位置的半胱氨酸；给予5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸（IAEDANS）体是蛋白质分子中48位置的色氨酸（Trp-48）,能量转移发生在AEDANS和Trp-48之间，据此计算在蛋白质中6，10，27位置到48位置的距离分别约是1.9，2.3和1.6nm.研究α型和突变体π型胞浆

谷胱甘肽转移酶的区别

通过用1-苯胺基－8－萘磺酸（ANS）为接受体标记胞浆谷胱甘肽转移酶的非催化位点，以胞浆谷胱甘肽转移酶中的催化位点色氨酸（Trp）残基为给予体，利用FRET研究人类α型和突变体π型胞浆谷光甘肽转移酶的区别。发现，α型中给予体-接受体间距离2.2nm,π型中距离1.82nm。