高中生物选修一2017-课题3血红蛋白的提取和分离(38ppt)

课题3血红蛋白的提取和分离一、蛋白质的提取、分离和鉴定的方法1.凝胶色谱法——血红蛋白的分离方法:(1)概念:根据_____________的大小分离蛋白质的有效方法,也称做___________。相对分子质量分配色谱法(2)原理:①凝胶

②分离原理:_________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程_____,移动速度较慢,通过凝胶的时间_____;__________________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程_____,移动速度较快,通过凝胶的时间_____。多孔球体

多糖类化合物贯穿的通道

相对分子质量较小较长较长相对分子质量较大较短较短2.缓冲溶液:(1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制_____________对溶液pH的影响,维持pH基本不变。(2)配制:通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,调节缓冲剂的_________就可以制得___________________的缓冲液。外界的酸和碱使用比例在不同pH范围内使用3.电泳——血红蛋白的分离或鉴定方法:(1)概念:带电粒子在_____的作用下发生_____的过程。(2)原理:①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有______________,在一定的pH下,这些基团会带上_____或_____。②在电场的作用下,这些带电分子会向着________________________移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子_______________以及分子本身的_____、_____的不同,使带电分子产生不同的__________,从而实现样品中各种分子的分离。电场迁移可解离的基团正电负电与其所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度二、蛋白质的提取和分离过程1.样品处理:血红蛋白由_____肽链组成,包括两条________和两条________。每条肽链环绕一个___________基团,此基团可携带_________或_______________。四条α-肽链β-肽链亚铁血红素一分子氧一分子二氧化碳(1)红细胞的洗涤:①目的:___________。②方法:去除杂蛋白黄色血浆暗红色红细胞五倍体积生理盐水(2)血红蛋白的释放：蒸馏水10(3)分离血红蛋白溶液:离心后试管中的溶液分为4层,从上往下依次为:第1层:无色透明的_______。第2层:脂溶性物质的_______——白色薄层固体。第3层:_________的水溶液——_____透明液体。第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中液体用_____过滤,除去_____________,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的_________液体。甲苯层沉淀层血红蛋白红色滤纸脂溶性沉淀层红色透明(4)透析——粗分离:①过程:取1mL的_________溶液装入_______中,将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的___________中(pH为7.0),透析12h。②原理:透析袋能使_______自由进出,而将_______保留在袋内。③目的:去除_____________________________。血红蛋白透析袋磷酸缓冲液小分子大分子样品中相对分子质量较小的杂质2.纯化——凝胶色谱操作:制作___________

装填___________:因为干的凝胶和用_____________的凝胶的体积差别很大,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填色谱柱时,不得有_____存在。

_________________凝胶色谱柱凝胶色谱柱缓冲液平衡好气泡样品的加入和洗脱3.纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:判断_____的蛋白质是否达到要求,需要进行蛋白质___________。鉴定方法中使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化纯度的鉴定【思考辨析】1.判断正误(1)凝胶色谱法分离蛋白质只根据分子大小,与其携带的电荷性质和大小无关。()√(2)不同蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质易通过凝胶颗粒,先从层析柱洗脱下来。(

)【分析】相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢,通过凝胶的时间较长,后洗脱下来;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,通过凝胶的时间较短,先洗脱下来。×(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质移动速度与蛋白质分子大小和其携带的电荷都有关系。(

)【分析】由于在凝胶中加入了SDS,其所带负电荷的量远远大于蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。×(4)透析过程中,用到的透析袋是一层选择半透膜,具有选择透过性。(

)【分析】透析袋是一层半透膜,小分子能通过,大分子不能通过。但不是一层选择透过性膜,选择透过性是针对有活性的生物膜来说的。×2.问题思考(1)鸟类血液和哺乳动物血液中,最好用哪种血液来提取血红蛋白?为什么?提示：哺乳动物血液。由于哺乳动物成熟红细胞中没有细胞核,容易获得血红蛋白。(2)红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,还含有细胞破碎物、脂质、甲苯等有机溶剂。怎样除去这些杂质呢?提示：红细胞破碎混合液→中速长时离心(2000r/min×10min)→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。一、血红蛋白的提取和分离的原理1.蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析:相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱顺序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来2.电泳方法:琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷,各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同在凝胶中加入SDS,使蛋白质解聚成单链,与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物,使其迁移速度完全取决于分子的大小【易错提醒】(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需要事先处理;电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。(2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小,而非所带电荷的性质和分子的形状。【典例训练1】(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述,不正确的是()A.洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D.在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中,血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢【解题关键】解答本题的关键是明确以下三点:(1)洗涤过程的目的和注意事项。(2)红细胞适合作为本实验的材料的特点。(3)洗脱过程中哪种分子移动更快。【解析】选D。本题考查血红蛋白的提取及凝胶色谱法分离蛋白质的原理。相对分子质量越大的蛋白质通过凝胶色谱柱的速度越快,故D错误。A正确,洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化,加入的是生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心,重复洗涤三次,直至上清液不再呈现黄色,表明红细胞已洗涤干净。B正确,哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器,提纯时杂蛋白较少。C正确,血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液(如果操作都正确,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出),这使得血红蛋白的分离过程非常直观,简化了操作。【变式训练】以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是()A.红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水,重复洗涤3次B.将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12小时C.凝胶装填在色谱柱内要均匀,不能有气泡存在D.蛋