怀山药种质资源玻璃化法超低温保存技术体系的建立

怀山药种质资源玻璃化法超低温保存技术体系的建立

甘薯又称带刺，是甘薯科的一种多年生包裹性藤本植物。主要产于河南省河南省徐州市的文县、武干、济阳等地（古怀庆地区管辖），具有良好的药物和食物优势。入药,具有健脾、补脾、固肾、益精、助五脏、强筋骨、益气力之功效;食用营养价值高,为滋补佳品,故素有“怀参”之称,其产品不仅畅销国内各地,还远销港澳地区和东南亚以及欧、美等地。目前对怀山药主要开展了栽培管理、组织培养、药用成分、加工工艺、药理作用以及病毒病和脱毒快繁等一系列研究工作,而关于种质资源则主要采用田间保存法,不仅需要大量的人力、物力和财力,而且还不可避免地受到病虫害和各种自然灾害的影响。因此,进行怀山药种质资源的离体保存研究就具有十分重要的意义。玻璃化法超低温保存是植物细胞和组织长期稳定保存的较好方法,可以节省空间,避免继代、病虫害和气候等因素造成的种质丢失,并且设备简单、操作简便,已经成功地应用于甘蔗、苹果、柿、胡萝卜、甘薯、紫罗兰等植物种质资源的保存。有关薯蓣的超低温保存在国外已有研究,但在国内尚未见报道。本试验成功地建立了怀山药种质资源玻璃化法超低温保存的技术体系,为怀山药种质资源的长期保存提供了一条有效途径。1材料和方法1.1代培养的药种试验材料为河南师范大学“四大怀药”组织培养室继代培养的怀山药无菌苗,共有5个品种,分别为铁棍山药(道地的怀山药)、47号山药(铁棍山药和滑县山药的杂交种)、B号山药、太谷山药和怀庆1号。1.2超低温保存技术以怀山药带芽茎段为材料进行玻璃化法超低温保存,并采用培养法检测保存后材料的成活率,从而筛选出最佳的玻璃化法超低温保存技术体系。该方法包括以下程序。1.2.1低温疲劳继代生长60d的怀山药的试管苗置于4℃冰箱中低温锻炼7d。1.2.2培训在无菌条件下切取1~1.5cm的带芽茎段,转至含5%蔗糖+3%甘露糖的培养基内,置4℃冰箱预培养2d。1.2.3不同保护剂的组成玻璃化保护剂(protectantofvitrifiablesolution,简称PVS)由不同配比的甘油、乙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖、甘露糖组成。本实验采用的5种玻璃化保护剂是参考刘云国对苹果茎尖进行玻璃化超低温保存的方法设置的,其组成成分见表1。预培养后的茎段先用60%的PVS在室温下处理60min,再用100%的PVS在0℃条件下处理60min。1.2.4材料的冷冻储存将玻璃化保护剂处理过的材料迅速放入液氮中,保存24h。1.2.5u3000发酵将材料从液氮中取出,采用4种方式化冻,分别为4℃冰箱、25℃常温、37℃水浴和45℃水浴,化冻后用含5%蔗糖的MS培养液洗涤4次,每次停留10min。1.2.6密度对生苗生长的影响将玻璃化超低温保存化冻洗涤后的怀山药茎段接种到再生培养基上进行培养,记录成活率及恢复生长的时间,并在60d时比较超低温保存后的再生苗与常温保存试管苗的形态差异。成活率=(玻璃化超低温保存后成活的茎段数)/(保存的总茎段数)×100%。本试验均为单因子试验,每次处理25个带芽茎段,实验重复4次。试验结果应用SPSS10.0统计软件进行Dunnett法和LSD法数据分析。实验中所使用的培养基均为MS+KT2mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂,培养温度为(25±2)℃,光照14h·d-1。2结果与分析2.1不同快速化冻条件下pvs1的成活率经不同玻璃化保护剂处理后的材料,投入液氮保存1d后,于37℃水浴中快速化冻,然后转至再生培养基上,30d时统计其成活率,结果见表2。由表2可以看出,在37℃水浴快速化冻的条件下,PVS1的成活率最高,达77.14%;其次是PVS3,成活率为67.02%;PVS2、PVS5的成活率差异不大,分别为42.09%和41.30%,没有达到显著水平;成活率最低的是PVS4,只有33.61%。而对照(CK)中因为没有玻璃化保护剂,导致细胞内结冰,细胞严重受损,成活率为0。通过Dunnett法和LSD法检验,各玻璃化保护剂与对照之间以及5种玻璃化保护剂之间进行比较,其成活率都达到极显著差异。可见,PVS1是进行怀山药种质资源玻璃化超低温保存的最佳玻璃化保护剂。2.2化冻温度对化冻效果的影响怀山药带芽茎段以PVS1为玻璃化保护剂,在液氮中保存1d后,采用不同的温度进行化冻,然后转入再生培养基上,30d时统计其成活率,结果见表3。由表3可以看出,不同的化冻方式对玻璃化超低温保存的效果也有影响,在以PVS1为玻璃化保护剂的条件下,随着化冻温度的升高,成活率也增大,当化冻温度为37℃时,山药带芽茎段的成活率达到最大值,当化冻温度继续升高至45℃时,茎段的成活率又开始下降。25℃常温化冻、37℃水浴快速化冻和45℃水浴快速化冻分别与4℃冰箱化冻的成活率进行Dunnett法检验,差异均达到极显著水平,进行LSD法检验,其成活率也都达到极显著差异。可见,37℃水浴快速化冻为怀山药种质资源玻璃化超低温保存的最佳化冻方式,化冻温度太高或太低都不利于茎段的成活。2.3再生苗的形态测定将经过玻璃化超低温保存后的怀山药带芽茎段与常温保存的怀山药带芽茎段同时接种到培养基上,前者10d开始恢复生长,15d茎段开始长出新芽,20d长出新叶,而后者7d即可恢复生长,13d长出新芽,18d长出新叶。60d时测定再生苗的形态指标,结果见表4。从表4可以看出,超低温再生苗与常温苗的形态指标基本一样,经Dunnett法检验,其株高、叶片数、芽数和茎节长虽有差异,但未达显著水平。说明用玻璃化超低温保存技术保存怀山药种质资源是合适的,能够保证遗传资源的稳定性。2.4不同菌株对渗透液中成活率的影响按照上述最佳的玻璃化超低温保存法(即采用PVS1和37℃快速水浴化冻)对怀山药5个品种的带芽茎段进行液氮保存,保存24h后转入再生培养基上,30d统计其成活率,结果如表5所示。由表5可以看出,怀山药玻璃化超低温保存后的相对存活率随基因型而异,表现出明显的品种间差异。经Dunnett法和LSD法检验,各怀山药品种之间以及47号山药(CK)与其他怀山药品种之间,成活率均表现出极显著的差异,其中,B号山药的相对存活率最高,达77.14%;怀庆1号和铁棍山药次之,分别为54.02%和67.24%,47号山药的相对存活率最低,仅为39.12%。3玻璃化保护剂的筛选玻璃化超低温(-196℃)保存是目前长期而稳定地保存植物种质资源的最好方法,在液氮低温下,所有的细胞分裂和代谢活动停止,因而植物材料在超低温保存过程中不会产生遗传性状的改变。该方法中起关键作用的是玻璃化保护剂,其基本原理在于植物材料经由玻璃化保护剂处理后,直接放入液氮时以玻璃态固化,不产生冰晶,从而避免冰冻造成的机械损伤和溶液效应损伤,目前已用于多种植物组织培养物的种质保存。艾鹏飞等对柿休眠芽茎尖进行了玻璃化超低温保存及植株再生研究,结果表明用玻璃化保护剂30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖处理材料时,成活率高达70.2%。曾继吾等也用此玻璃化保护剂对番木瓜含1~2个叶原基的茎尖(1.5~2.5mm长)进行玻璃化超低温保存24h后,转入继代培养基上再培养,成活率和再生率分别达53.7%和52.6%。周小梅等对玉米遗传转化中常用的受体材料幼胚、胚性愈伤组织和悬浮细胞系进行了玻璃化法超低温保存,发现采用同样保护剂,材料的相对存活率也可达80%。D.Hirai和A.Sakai在优化甘薯超低温保存条件时,指出这一玻璃化保护剂能显著提高甘薯茎尖的存活率,存活率达60%以上。但刘云国等在研究苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术时发现,以30%甘油+15%乙二醇+30%DMSO或40%甘油+10%乙二醇+5%DMSO+45%蔗糖作玻璃化保护剂的效果较好,成活率可达79%。Leunufna等对薯蓣(Dioscorea)4个品种(D.bulbiferaL.,D.oppositifoliaL.,D.alataL.和D.cayenensisLam.)的茎尖(2~4mm)进行玻璃化超低温保存时,发现13.7%蔗糖+30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO作保护剂的效果较好,成活率和再生率高达86%和100%。非洲紫罗兰茎尖进行玻璃化超低温保存时,采用10%DMSO+0.5mol/L蔗糖或5%DMSO+0.75mol/L蔗糖作玻璃化保护剂也能达到80%~100%的存活率和80%的再生率。本试验发现怀山药的最佳玻璃化保护剂为PVS1(22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙二醇+10%DMSO),在它的作用下,超低温保存后茎段转入培养基上再培养时,成活率可达77.14%。可见,植物种类不同或者超低温保存的组织培养物不同,所需要的玻璃化保护剂也不同。在进行玻璃化超低温保存时,不仅要筛选出合适的玻璃化保护剂,而且还必须筛选出符合试验材料特性的化冻方式。对于不同的材料,化冻方式也不同,一般以35~40℃水浴快速化冻的效果较好。陈勇等在胡萝卜细胞和原生质体的玻璃化法超低温保存的研究中发现,0℃低温化冻,其存活率仅为59.4%,25℃常温化冻存活率为69.7%,而37℃水浴快速化冻可明显提高材料的存活率,高达83.3%。陈勇等还对瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存进行了研究,比较了4~6℃低温、室温、自来水冲洗及30℃、40℃、50℃水浴不同化冻方式对瓯柑愈伤组织玻璃化冻存后存活率的影响,发现不同化冻方式对瓯柑愈伤组织存活率的影响较大,在4~6℃冰箱内慢速化冻、室温和30℃水浴化冻的TTC值较低,细胞生活力较弱,自来水流水(18.5±2)℃冲洗化冻和40℃水浴化冻的存活率较高,化冻后的愈伤组织保持了较高的生活力,TTC值相近,分别为71.84%和85.62%。本试验对怀山药茎段进行玻璃化超低温保存,结果也表明37℃水浴快速化冻可以明显提高茎段的成活率,是怀山药的最佳化冻方式。但有些木本植物的冬芽超低温保存后必须在0℃低温下化冻才能达到最好的效果。可见,保存材料不同,其化冻温度也不相同。在进行玻璃化超低温保存时,如果基因型不同,则保存效果也会存在明显的差异。王子成等对柑橘的4个品种进行了玻璃化超低温保存,发现枳壳和橙柑的存活率最高达100%,脐橙次之,为93.33%,红肉存活率最小,为91.67%。S.Leunufna等对薯蓣4个品种的茎尖进行玻璃化超低温保存时,也发现各品种间的存活率存在差异,其中D.oppositifoliaL.存活率最高