第二章生物制药工艺技术基础

第二章生物制药工艺技术基础第1页，课件共53页，创作于2023年2月

一、生物材料的选择：

1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质

2．生物材料的采集与质控

（1）品种鉴定；（2）防止污染与感染；（3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存

第一节生物药物提取、分离、纯化技术基础第2页，课件共53页，创作于2023年2月

二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化

（一）几种常用提取方法

1．酸、碱、盐水溶液提取方法

2．表面活性剂提取方法与反胶束提取方法

3．有机溶剂提取

4.双水相萃取法

5．超临界萃取法

第3页，课件共53页，创作于2023年2月（二）提取方法与优化

1.溶剂选择

2.选择添加剂①保护剂；②酶抑制剂

3.提取条件①温度；②pH；③盐；④表面活性剂第4页，课件共53页，创作于2023年2月三．浓缩与干燥1.浓缩方法：①盐析；②有机溶剂沉淀；③高分子脱水④超滤；⑤真空浓缩或薄膜浓缩；

（书P45页）第5页，课件共53页，创作于2023年2月第6页，课件共53页，创作于2023年2月2.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥

（书P47页）第7页，课件共53页，创作于2023年2月第8页，课件共53页，创作于2023年2月第9页，课件共53页，创作于2023年2月四、分离纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点:(1)生物材料组成复杂(2)目的物含量低(3)易变性、失活(4)分离方法有很大经验成分(5)步骤多，逐级分离(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同(书P49页)第10页，课件共53页，创作于2023年2月2.分离纯化原理P49页(1)根据分子形状与分子大小(2)根据电荷差异(3)根据分子极性与溶解度大小(4)根据吸附特性(5)根据生物配基特性第11页，课件共53页，创作于2023年2月3.选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制：高分辨率多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦第12页，课件共53页，创作于2023年2月

第二节微生物制药工艺技术基础

一、菌种的选育与保藏1．自然选育依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。方法：（1）平板划线法（2）稀释平板法第13页，课件共53页，创作于2023年2月2．诱变育种（1）出发菌株的选择①:稳定性;②:具备某种优良性状的菌株③:对诱变剂敏感;④:生理状态及生长时间（2）诱变处理:①化学诱变；②物理诱变;③生物诱变（3）筛选：①随机筛选；②半理性化筛选第14页，课件共53页，创作于2023年2月突变株筛选一般进程如图所示

第三第四轮同第二轮第三第四轮同第二轮第15页，课件共53页，创作于2023年2月3、现代菌种选育技术①：杂交育种②：原生质体融合③：基因工程技术

(P55页)第16页，课件共53页，创作于2023年2月3．菌种保存（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法①防止基因突变：如低温保藏②采用双重缺陷型③制作平行的菌种斜面，少传代④分离单菌落，自然筛选⑤选择培养条件第17页，课件共53页，创作于2023年2月（4）菌种保藏方法：①斜面低温保存②液体石蜡封藏法③甘油冷冻法④冷冻干燥法⑤液氮保藏法第18页，课件共53页，创作于2023年2月二、发酵工程技术基础

发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。

1．液体培养——深层发酵

2．固体培养——浅盘培养发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。

第19页，课件共53页，创作于2023年2月图1L-Lys生产过程工艺设备图第20页，课件共53页，创作于2023年2月

第三节生物技术药物制造技术基础

一、重组DNA技术原理1．基因工程操作过程：

（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。

第21页，课件共53页，创作于2023年2月2．基因工程药物制造过程第22页，课件共53页，创作于2023年2月二、基因工程主要操作技术1．目的基因的获得（1）cDNA文库纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆第23页，课件共53页，创作于2023年2月目的基因的获得：cDNA文库第24页，课件共53页，创作于2023年2月（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）

典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。第25页，课件共53页，创作于2023年2月第26页，课件共53页，创作于2023年2月（3）化学合成法

在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。第27页，课件共53页，创作于2023年2月2．DNA重组体的构建根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。（2）芽孢杆菌pUB110pE194和pC194（3）链霉菌pIJ101pSG5cDNA与载体连接方法①同聚尾连接法②人工接头连接法第28页，课件共53页，创作于2023年2月3．重组体的表达系统（1）原核表达系统①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性第29页，课件共53页，创作于2023年2月（2）真核表达系统①酵母表达毕赤酵母（pichiapsatoris）受甲醇诱导优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。②动物细胞哺乳动物细胞——CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞——家蚕细胞第30页，课件共53页，创作于2023年2月4．表达产物的纯化包含体inclusionbodies:大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。第31页，课件共53页，创作于2023年2月

为防止或减少包含体的形成常用方法：

（1）降低培养温度从37℃降到30℃可显著降低包含体形成率。（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。第32页，课件共53页，创作于2023年2月三、酶工程制药技术基础1、酶工程(enzymeengineering)研究内容（1）酶的发现、分离纯化与生产应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）抗体酶、模拟酶合成酶及酶的人工设计。（书P102）第33页，课件共53页，创作于2023年2月2、固定化酶(immobilizedenzyme)（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）便于产物的分离、纯化第34页，课件共53页，创作于2023年2月共价键结合酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶第35页，课件共53页，创作于2023年2月3、制备方法：（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺（3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。（4）交联法：用双功能试剂将酶与载体交联固定化

图:酶固定化方法示意1.离子结合2.共价结合3.交联4.聚合物包埋5.疏水作用6.脂质体包埋7.微胶囊第36页，课件共53页，创作于2023年2月第四节生物制药工艺中试放大设计

一、中试放大目的与规模1．目的：（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究；（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用。第37页，课件共53页，创作于2023年2月2．规模：中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键。第38页，课件共53页，创作于2023年2月3、中试放大时应具备的条件（1）有稳定的工艺：收率，质量可靠（2）操作条件基本确立（3）已建立中间品和成品分析方法（4）生物材料已鉴定（5）物料平衡、三废处理已基本解决（6）中试规模、产品产量，规模已确定（7）安全生产已有方案第39页，课件共53页，创作于2023年2月4．中试放大要解决的问题（1）原辅材料规格（2）设备选型与材质选用（3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控标准与检定方法（5）下游工艺优化与稳定制造规程的制定第40页，课件共53页，创作于2023年2月二．中试放大方法与总结内容1、放大方法

（1）经验放大（2）相似放大（3）数学模型放大2、总结内容：（1）确定工艺路线，优化工艺条件，制定制造规程。（2）制定岗位操作、投产（3）进行材料衡算（4）安全生产与处理（5）原辅料及产品质控方法与标准测定。（6）产品规格标准制定（7）消耗定额，成本核算，工时，生产周期计算。

第41页，课件共53页，创作于2023年2月

第五节生物制药工艺技术若干进展

一、21世纪的热门生物技术

1．组合生物合成组合生物合成(combinatorialbiosynthesis)或组合生物学(combinatorialbiology)是指应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇,产生一些新的非天然的基因簇,从而合成许多新的非天然的化合物,为生物药物的筛选提供丰富的化合物资源第42页，课件共53页，创作于2023年2月

微生物药物通常是由非常简单的化学物质,如小分子羧酸或某些氨基酸作为合成起始单位和延伸单位合成的,参与合成的酶为一系列基因编码的多酶体系(构成一个合成途径)。研究表明,参与这类小分子生物合成的基因通常是连锁或邻接而构成一个基因簇(cluster),这为基因的克隆和操作提供了方便,同时由于参与次级代谢生物合成酶系对底物的特异性,专一性要求不是很严格的,对结构相类似的底物均可识别,这一特点为不同基因组合产生新的化合物创造了条件。第43页，课件共53页，创作于2023年2月组合生物合成技术在药物研发中的应用酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯醇还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等功能域第44页，课件共53页，创作于2023年2月第45页，课件共53页，创作于2023年2月组合生物合成技术示意图酶1酶2酶3化合物A

B

C

D酶1基因酶2基因酶3基因基因克隆AD质粒转移至宿主菌酶或蛋白质第46页，课件共53页，创作于2023年2月

2．药物基因组学是一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物的反应的一门科学。由对基因的研究发现带有某种特定基因的人，会对某种特定的药物成份，产生某种特定的反应。将这个基因、药物成份与服用后反应的一连串关联，运用在用药之上，就可以知道带有某特定基因之人，不适合服用含有某特定成份的药物，进而降低药物副作用产生的风险；反之，也可以知道带有某特定基因之人，特别适合服用含有某特定成份的药物，进而提升治愈疾病的机率

3．药物蛋白质组学第47页，课件共53页，创作于2023年2月