淀粉酶活性测定

谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是a-淀粉酶和8-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。a-淀粉酶随机水解淀粉的a-1，4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；8-淀粉酶水解非还原端的第二个a-1，4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中a-淀粉酶和8-淀粉酶活性的差异。【原理】两种淀粉酶具有不同理化特性，a-淀粉酶不耐酸，在PH36以下迅速钝化；8-淀粉酶不耐热，在70°C下15Min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化8-淀粉酶测出a-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出8-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。【仪器与用具】分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25M113支，刻度吸管1ml、2ml、5M1各1支；容量瓶50M12支。【试剂】麦芽糖标准液(1Mg/M1)：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100M1。DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20Ml2Mol/LNAOH溶液中，加入50M1蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100M1。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊，可过滤后使用。01Mo1/LPH56的柠檬酸缓冲液：A液（01Mo1/L柠檬酸）：称取分析纯柠檬酸2101g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（01Mol/L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠2941g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为01Mol/LPH56的柠檬酸缓冲液。%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml01Mol/LPH5 6的柠檬酸缓冲液中。【方法】1.酶液提取称取25°C下萌发3〜4天的小麦种子1 0g（芽长1 0〜15CM），置研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15〜20Min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/Min转速下离心10Min，将上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。2麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-1加入试剂：表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg）00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml）2222222摇匀，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20Ml。以1号管作为空白调零点，在540nM波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。3酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-2进行操作。表18-2酶活力的测定配方表操作项目管号I-11-21-311-111-211-3淀粉酶原液(ml)1.01.01.0000钝化。-淀粉酶置70°C水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液(ml)000111DNS试剂(ml)2.0002.000预保温40C恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液(ml)(40C)1.01.01.01.01.01.0保温40C恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂(ml)02.02.002.02.0摇匀，置沸水浴中5Min，取出后冷却，加蒸馏水至20M1，摇匀，在540nM波长下比色，记录测定结果。4结果计算用I-2、I-3吸光度平均值与I-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，再按下式计算a-淀粉酶的活力(Aa)，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg/g・Min)表示：Aa=CaVTFWXtXV1(18-1)11-2、n-3吸光度平均值与II-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，按式18-1计算(a+8)-淀粉酶的活性ATAT=CTXVTFWXtXV1式中A:淀粉酶活性，Aa为a-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是a、8-淀粉酶的活性；Ca:a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值，以下同)；CT:(a+8)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；V1:显色所用酶液体积(Ml)；T:酶作用时间(Min)；VT:样品稀释液总体积(a-淀粉酶为50M