elisa试验的常见问题及解决方法

elisa试验的常见问题及解决方法

酶联免疫吸附试验（elisa）是一种测定免疫酶免疫抑制酶免疫的技术。ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用,但是操作中的各个环节对试验的检测结果影响较大,如不注意排除干扰因素,有可能导致显色不全、花板等现象。现将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下,以期给同行带来一些启发,提高试验质量。1试剂的原因1.1试剂灵敏度差异试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关,但不同厂家出产的试剂灵敏度与特异度存在一定的差别,要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂,不要用无批号的试剂,最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。1.2假阴性法的后果在临床实验室,对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20~30min后再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,这样做的目的是能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求。2标本采集和凝固不全2.1标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性,严重溶血标本禁用。2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色。因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5d之内应4℃保存,1周后检测应低温冻存;同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染。冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果。因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的样本避免反复融冻。2.3标本凝固不全:正常血液采集后0.5~2h开始凝固,18~24h完全血块完全收缩。在工作中,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉,易造成假阳(阴)性结果;因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。3运营规则3.1加样器的清洗加样要准确,滴加试剂时应垂直滴加,不得倾斜、人为的加大试剂量。加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会,建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。做到一人一移液头,防止交叉污染。加标本应加在微孔底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。3.2温度测定方法温育影响,96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异;干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,温育时间应按规定力求准确。温箱温度必须严格控制。温育过程中应封闭,避免边缘效应。3.3洗板机洗板的制备冼涤是ELISA操作的重要环节,手洗条件一致性较差,对结果影响较大,半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果,血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性;洗板机洗板时每天进行注液量和残液量的校正,使用完毕后用蒸馏水冲洗。洗涤时确认注满每个反应孔,洗涤后残液量不得>2μl,最后将孔内液体拍干。为了洗涤效果更好,实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1~2次,或适当增加洗板的次数,有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果。3.4酶标的测定显色时间应严格按操作规程作。显色终止15min内酶标仪读取,酶标仪不应置于阳光或强光照射下,先预热15~30min再进行测试。肉眼判断结果时,显色浅不易观察,影响结果的准确性,必须使用酶标仪检测,以保结果一致性。3.5elisa法控制变量的确定每批测试均应做好质控,建立严格的审核制度,对检验结果判断是否准确,可靠有效,异常结果复查与临床医生及时沟通,对室间质评结果分析处理,找出失控原因及再控经验。综上所述,尽