柞树单宁提取工艺的研究

柞树单宁提取工艺的研究

植物单体又名丹宁、丹宁酸、单宁酸、水杨酸、提取物或未经处理的酸。根据baresmith的定义，它指的是含有500-3000吨能耗沉淀碱、明胶和其他蛋白质的多元醇醚。它广泛存在于植物的芽、叶、根苗、树皮和果实等组织中,以及某些寄生于植物的昆虫所产生的虫瘿中,主要应用于医药、食品、制革、日用化学品、冶金、水处理等领域。单宁作为一种可再生的结构多样的高度聚合多酚类化合物,有活泼的化学性质,其潜在的用途还十分广阔,受到学者们的密切关注。其结构复杂,人工合成不易,植物单宁分布广、数量大、用途多、应用前景广阔,从而逐渐被人们所认识,已经引起了国内外广泛的关注。由于单宁不易人工合成,目前国内外主要从含有单宁的天然植物及植物虫瘿五倍子中采用水或其他溶剂提取,所以测定、评价和开发含有单宁的植物对于扩大天然单宁来源具有重要意义。我国柞树资源分布辽阔,全国柞林面积约有1314万hm2,其中开发为柞蚕场的只有78.6万hm2,占柞林总面积的5.98%,常年用于放养柞蚕的面积43.7万hm2。每年柞蚕场轮伐更新及整枝修剪产生大量的柞树枝叶大多没有得到很好的利用而被浪费。为充分利用柞树资源,提高柞蚕产业附加值,本文重点研究了柞树单宁提取工艺及不同柞树种类之间单宁含量的比较,旨在为柞树枝叶的有效利用和产业开发提供理论依据。1材料和方法1.1部位样品及主要试剂供试材料:5个柞树品种,包括麻栎、辽东栎、蒙古栎、槲及锐齿槲栎;不同部位样品,包括绿叶、落叶及枝条。主要药剂及仪器:单宁酸标准品、无水乙醇、盐酸、钨酸钠、磷钼酸、无水碳酸钠、磷酸、丙酮、甲醇等,所用试剂均为分析纯;恒温干燥箱,粉碎机,可见分光光度计,恒温水浴锅,电子天平。1.2测试方法1.2.1枝条的制备将采集回来的柞树叶先洗干净,自然风干,柞树枝条先剪成小段,然后按品种和类别放入恒温干燥箱中,在70℃的恒温条件下烘干至恒重,最后分别进行粉碎装袋备用。1.2.2提取剂的选择1)提取剂的选择:在料液比1∶20,提取时间1h,提取温度55℃的条件下,比较不同的提取剂对单宁提取率的影响,选择合适溶剂作为提取剂。2)提取方法:精确称取适量上述制备的柞树叶(枝)粉末于锥形瓶中,加入一定比例的提取剂,混匀,置于恒温水浴锅中浸提,纱布过滤得到滤液备用。1.2.3本方法的标准曲线1)Folin-Denis显色剂的配制:称取钨酸钠50g,磷钼酸10g,加入蒸馏水375mL溶解,加入85%磷酸25mL,酒精灯加热回流2h,冷却后定容至500mL,棕色瓶贮存(常温下可保存14d)。2)碳酸钠溶液配制:称取无水碳酸钠溶于250mL温水中,混匀、冷却,稀释至500mL,过滤到储液瓶中备用(室温下可保存7d)。3)单宁酸标准曲线的绘制:称取单宁酸0.1±0.001g,蒸馏水定容至100mL,作为单宁酸储备液;从标准品中准确吸取10mL稀释定容至100mL,作为单宁酸标准使用液,浓度为100mg/L。精密吸取单宁单宁酸标准使用液0mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL,分别置盛有约30mL水的50mL容量瓶中,加F-D显色剂2.5mL,再加碳酸钠溶液5.0mL,分别用蒸馏水定容至50mL,摇匀。单宁酸标准溶液浓度分别为0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L,在15-30℃范围内,放置30min显色后,用1cm比色皿在755nm波长处测定标准系列溶液的吸光度A,绘制标准曲线。4)柞树单宁的测定方法:准确吸取一定量的待测样品液,以空白试剂作参比(0mg/L),与标准溶液同法测吸光度,根据标准曲线计算单宁的提取率。5)单宁提取率(%)的计算公式:其中,W为柞树样的质量(mg);V1为提取液总体积(mL);V2为比色时所吸提取液体积(mL);P为从标准曲线查得的提取液所含单宁(mg/P=0.1x,x为单宁酸标准曲线的横坐标值)。6)单因素试验:以辽东栎绿叶样品为材料,料液比采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶30和1∶40五个水平,浸提时间采用1h、1.5h、2h、2.5h和3h五个水平,浸提温度采用35℃、45℃、55℃、65℃和75℃五个水平,分别进行单因素试验。7)正交试验:为了验证各单因素间的相互作用效果,选用对单宁得率影响较大的料液比、提取时间、提取温度3个因素进行三因素三水平L9正交试验,确定提取柞树中单宁的较优工艺参数。所采用的材料是辽东栎绿叶样品。1.2.4数据分析试验数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,F检验采用单变量多因子方差分析,多重比较用duncans法。2结果与分析2.1宁酸标准曲线以吸取标准溶液的体积为横坐标,吸光度为纵坐标作图,得到单宁酸标准曲线(图1)。标准方程为:y=0.0644x+0.0056,相关系数R2=0.9981,单宁酸在0~12mg/L,呈现良好的线性关系,能满足测定柞树中单宁含量需要。2.2橡胶单提取的个别原因2.2.1提取溶剂的选择柞树中的单宁物质为分子量较大的水溶性多酚类物质,具有很强的极性,极易溶于有机溶剂,因此,可利用它在这些溶剂中的高度溶解性,选取适当溶剂将单宁最大限度的溶出。料液比1∶20、提取时间1h、提取温度55℃,考察了80%乙醇(含1%盐酸)、70%丙酮(含1%盐酸)和70%甲醇(含1%盐酸)3种溶剂的提取效果,如图2所示。由图2可知,不同提取剂提取柞树单宁的提取率差异明显,以80%乙醇(含1%盐酸)效果为最好,与其他2种提取剂的提取率差异达到极显著水平(p<0.01),提取率为3.5000±0.0854%,而选择对单宁溶解性好、提取率高的乙醇溶液作为提取剂。2.2.2比对桐树叶片提取率的影响在提取温度55℃,提取时间1h,80%乙醇(含1%盐酸)作为提取剂的条件下,改变液料比,考察其对柞树单宁提取率的影响,结果见图3。由图3可知,料液比在1∶20时提取量明显最高,与其他4个比例的料液比提取率差异达到极显著的水平(p<0.01),提取率为1.6265±0.0109%。料液比的上升会增加单宁的溶出量,到达一定比例后,上升的幅度明显下降。2.2.3结果图1在提取温度55℃、料液比为1∶15、80%乙醇(含1%盐酸)作为提取剂的条件下,改变提取时间,考察其对柞树单宁提取率的影响,结果见图4。由图4可知,在2h之内,随着提取时间的增加,柞树单宁提取率也有所增加,2~2.5h内,增加趋势有所下降,3h处提取率达到最高,并且提取率差异与1h和1.5h达到极显著水平(p<0.01),而与2h和2.5h的提取率差异不显著,所以,本试验初步选择经济合理的提取时间为2h,提取率为8.7515±0.3171%。2h后柞树单宁的提取率有所下降并逐渐趋于平衡。2.2.4整理温度对阻燃整理效果的影响在选取提取时间为2h、料液比为1∶15、80%乙醇(含1%盐酸)作为提取剂的条件下,改变提取温度,考察其对柞树单宁提取率的影响,结果见图5。由图5可知,伴随着温度的上升单宁提取率明显上升,65℃时提取率达到最高,之后提取率出现下降。65℃时提取率为9.9783±0.6175%,且与其他温度下的提取率的差异达到极显著水平(p<0.01)。温度升高有利于溶剂渗入到原料内打开单宁-蛋白质的连接键,温度过高可能导致柞树单宁部分被氧化,从而降低了提取率。2.3正交试验结果在单因素试验的基础上,确定影响单宁提取率的因素主要有提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C),以上因素既互相影响又互相制约,因此,为得出单宁提取的较优工艺条件,进行了L9(33)正交试验。试验的因素和水平见表1,试验结果见表2。根据表1、表2的极差分析可知,所定的3个因子的极差大小顺序为:A>B>C,通过极差分析计算,得出的较优组合为,即提取温度75℃,提取时间2.5h、料液比1∶15。2.4不同提取次数对桐树单株提取率的影响选择提取剂为80%乙醇(含1%盐酸)、提取温度为75℃、提取时间2.5h、料液比1∶15作为柞树单宁提取工艺,比较不同提取次数对柞树单宁提取率的影响,结果见图6。由图6可知,第1次所提单宁的量占所提单宁的总量的76.562%,第2次提取的量占所提总单宁的18.841%,2次所提的单宁占所提总单宁的95.403%,从生产角度考虑柞树单宁的提取次数以2次为宜。2.5叶片叶绿素的选用由表3、图7可以看出,五种柞树(蒙古栎、槲、辽东栎、锐齿槲栎和麻栎)的绿叶中单宁含量均明显高于落叶和枝条中的单宁含量,所以选用柞树绿叶作为整个试验过程中的原料是非常合理且正确的。绿叶中的单宁含量从高到低为:麻栎>辽东栎>蒙古栎>锐齿槲栎>槲;落叶中的单宁含量从高到低为:麻栎>蒙古栎>槲>辽东栎>锐齿槲栎;枝条中的单宁含量从高到低为:麻栎>槲>锐齿槲栎>蒙古栎>辽东栎。3提取方法的选择目前植物单宁提取的方法一般有温水提取、有机溶剂萃取法、超声波法、微波法、超临界流体萃取和半仿生提取法等。单宁含量测定方法也较多,经典测定方法有皮粉吸附法、干酪素法、氧化滴定法、胶体滴定法、络合滴定法、分光光度法、比色法等,现代测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、原子吸收分光光度法等。本试验单宁的提取采用有机溶剂萃取法,该方法不需要特殊的仪器,应用比较简单,具有快速、简便、成本低廉、方便实用等特点