四种栎属遗传多样性的ssr分析

四种栎属遗传多样性的ssr分析

随着过程技术的发展，植物est序列的数量日益增加。通过est序列开发神圣斯瑞克林堡的分子标记成为一种经济有效的方法（徐玉林等，2012）。许多木本植物,如茶树(金基强等,2006)、桉树(李淑娴等,2010)、柽柳(张如华等,2011)、白桦(王艳敏等,2008)、橡胶树(安泽伟等,2009;Fengetal.,2009)、核桃(朱艳等,2009)、荔枝(孙清明等,2011)、银杏(樊洪泓等,2009)、中国板栗(向闱等,2010)、杨树(LiandYin,2007)等的EST-SSR信息已有所报道,通常报道的EST-SSR的信息包括EST-SSR在EST中的分布频率、大小、引物开发以及通用性检测等。栎属(Quercus)属于壳斗科(Fagaceae),为壳斗科中的第一大属,该属不仅种类最多,而且分布最广。全世界约有三百余种栎属植物分布,中国分布有六十余种。微卫星标记是在栎属中被广泛运用的一种分子标记,微卫星在栎属群体的遗传多样性水平、群体遗传分化与结构、群体间的基因流及交配系统等方面都得到了广泛的应用。然而目前用于栎属分子研究的微卫星主要来自Kampfer等(1998)从欧洲栓皮栎(Quercusrobur)开发的32对(GA)n重复基元的SSR引物,Steinkellner等(1997)从无梗花栎(Quercuspe-traea)中开发的17对(GA/CT)n重复基元SSR;Dow等(1995)从大果栎(Quercusmacrocarpa)中开发的3对(GA/CT)n重复基元的SSR;DowandAshlely(1996)从大果栎中开发的1对引物。因此,栎属中所使用的SSR引物至今为止仍然很少,需要更多的SSR标记的开发进行补充,以增加位点数,为栎属的遗传多样性研究服务。1结果与分析1.1蒙古栎的est序列对蒙古栎、无梗花栎、夏栎、欧洲栓皮栎的EST序列长度及GC含量进行分析如表1和图1所示。其中,夏栎的EST序列最多,有81671条,总长度达到47031157bp,而蒙古栎的EST序列有3385条,总长度1855072bp。四种栎类的平均EST序列的长度均为500bp左右,GC含量均为40%左右。1.2电子法上ssr的变化由表2可见,蒙古栎、无梗花栎、夏栎和欧洲栓皮栎的EST序列中绝大部分是一个EST序列中含有一个SSR,在蒙古栎、无梗花栎、夏栎和欧洲栓皮栎中分别有423条、3978条、6372条和511条EST,每条EST序列都是只含有一个SSR,每条EST序列含有两个SSR的情况在四种栎类中出现也较多;最多的甚至可以达到1条EST序列中含有8个SSR,在夏栎中就出现了这样的情况。1.3ssr的长度和分布根据统计,由表3,在蒙古栎、无梗花栎、夏栎和欧洲栓皮栎EST序列中分别有578个、5116个、7994个、589个SSR存在。据四个栎树用于查找这些SSR的EST序列总长度,蒙古栎中3209.46bp有一个SSR、无梗花栎中每6160.36bp有一个SSR、夏栎中每5883.30bp有一个SSR、欧洲栓皮栎中每6129.12bp有一个SSR。且在四种栎类中均是二基元、三基元和六基元的SSR远远多于四基元和五基元的SSR。在蒙古栎中SSR的平均长度从19.25bp到25.95bp,平均21.65bp,无梗花栎的SSR平均长度为21.1bp、夏栎SSR的长度为20.66bp,欧洲栓皮栎SSR的平均长度为20.65bp。四种栎类的SSR长度差别不大。由图1可见,不同重复基元的SSR在四种栎类的分布频率,有着非常明显且一致的分布特征。在四种栎类中均是二基元、三基元和六基元的SSR最多,这三种类型的SSR在四种栎类中都达到了25%以上D,且在四种栎类中均是二基元的SSR的分布频率>六基元SSR的分布频率>三基元SSR的分布频率。而四基元和五基元的SSR在四种栎中的分布均小于0.05%。1.4两基元ssr的频率分布如表4所示,不同基元的SSR在四种栎类中出现的频率具有很大的差异。由于在四种栎类中,各种类型的基元出现频率不一,有的基元的出现频率甚至只有千分之一,为寻找普遍规律及分析的便利,取出现频率大于1%的基元类型用于最终的结果分析。结果表明:在蒙古栎中,二基元的SSR中:CT基元出现的频率最高,达到了15.22%,TC基元其次,出现频率为9.34%,AG基元出现的频率也较高,为7.27%。而其它的二基元SSR如AT、GA、TA的出现频率则很低,只是略高于1%;三基元的SSR中:CTT和CAA基元的出现频率达到了2%以上,分别为2.77%和2.42%,GAA和AGA基元的出现频率分布达到了1.73%、1.56%,而其余的基元如ACA、ATA、GAG、GAT、TAT、TCT、CTC基元均未达到1.5%;六基元的SSR中:CTCTCA出现频率最高,为1.90%,AACCCT的出现频率也达到了1.21%,其它高于1%的六基元SSR中AAGCCA和CACAAC的出现频率均为1.04%。在无梗花栎中,二基元SSR出现的频率与蒙古栎类似,大于1%的二基元SSR均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且也是AG、CT、TC基元的分布频率最高,分别为8.01%、7.76%、7.58%、但是略不同的是在无梗花栎中的分布频率也较高,达到了3.62%和2.58%,分布频率最低的二基元SSR为基元,频率为1.54%;三基元的SSR中:CTT、GAA、AAG的分布频率最高,分别为2.44%、2.93%、1.99%,GAG基元也达到了1.52%,而其它的三基元SSR如CAA、GAT、TCT、TTC等均略高于1%。在无梗花栎中四基元、五基元以及六基元的SSR的分布频率均没有达到1%的。在夏栎和欧洲栓皮栎二基元SSR的分布频率中出现了跟蒙古栎和无梗花栎类似的情况,即均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且也是AG、CT、TC基元的分布频率最高。而略不同的是各基元的频率不相同,在夏栎和欧洲栓皮栎中AG、CT、TC的分布频率幅度为,夏栎7.57%、7.87%、8.48%;欧洲栓皮栎7.30%、6.45%、9.34%。欧洲栓皮栎中GA的分布频率也很高,达到了9.51%。夏栎和欧洲栓皮栎的三基元SSR中分布频率最高的基元分别是GAA和CAA数值为3.75%和2.21%。夏栎中六基元SSR有三种类型AACCCT、TAGGGT、TG-GAGG分布频率均略高于1%。欧洲栓皮栎中六基元的SSR有四种类型,分别为AACCCT、AAGATG、TCTTCA、TAGGGT,其中,AAGATG、TCTTCA的分布频率达到了2.72%和3.40%。2电子确定度分析从NCBI下载了蒙古栎、无梗花栎、夏栎、欧洲栓皮栎的EST序列共计149976条,寻找其中的SSR,分析四种栎类EST-SSR的特点。在蒙古栎、无梗花栎、夏栎、欧洲栓皮栎EST序列中分别有578、5116、7994、589个SSR存在,分别占四种栎类EST的17.07%、8.78%、9.78%、17.40%,四种栎类的SSR在EST中的平均分布频率为13.25%。这一频率略高于白桦EST序列中SSR出现的频率(12.05%)(王艳敏等,2008)。但是这个数值远远高于甘蔗的2.9%(Cordeiroetal.,2001)、水稻的4.7%(Kantetyetal.,2002)、普通小麦的5.4%(Guptaetal.,2003)。这种差异可能是由于物种之间本质存在分布频率差异造成的,不同的搜索软件,以及对搜索条件界定(SSR长度,基元重复次数等)也可能造成这种差异。EST-SSR在各种植物中分布的频率差异很大,从每2kb到20kb左右都有可能。从SSR在EST上的分布频率来看,蒙古栎中3209.46bp有一个SSR,无梗花栎中每6160.36bp有一个SSR,夏栎中每5883.30bp有一个SSR,欧洲栓皮栎中每6129.12bp有一个SSR。在草莓中的出现频率为平均每5.52kb1个SSR(王静等,2011),与夏栎的出现频率一致。蒙古栎中,SSR的平均长度21.65bp,无梗花栎SSR的平均长度为21.1bp,夏栎SSR的平均长度为20.66bp,欧洲栓皮栎SSR的平均长度为20.65bp。四种栎类中不同基元SSR的分布频率有极大的相似性,四种栎类中均是二基元、三基元和六基元的SSR分布频率最高,均达到了20%以上。而四基元和五基元的SSR在四个种类中的分布不到0.05%。二核苷酸是在植物中分布最高的重复序列(Cardleetal.,2000)。四种栎类中也是二基元的SSR分布最高。据报道,三基元的SSR在甘蔗以及普通小麦中的分布也较高,分别为90%以上和67.12%(Cordeiroetal.,2001;Guptaetal.,2003),本研究中三基元的SSR的分布频率仅有20%左右。而六核苷酸的分布频率达到20%以上的报道很少见。相似性还体现在,二基元的SSR中大于1%的SSR均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且在蒙古栎、无梗花栎、夏栎AG、CT、TC基元的分布频率最高,而在欧洲栓皮栎中是TC、GA、AG的分布频率最高。而GA是蒙古栎、无梗花栎、夏栎中分布频率居第二的二基元SSR,它的分布频率在几种栎类之间差异性很大,在蒙古栎、无梗花栎、夏栎、欧洲栓皮栎中GA的分布频率分别为1.90%、3.62%、3.62%。三基元的SSR中,含CAA、GAA、TCT、CTT的SSR在四种栎类中都存在。六基元的SSR在四种栎类中出现的类型均较少,为0~4种。GA重复是大多数植物二基元的SSR出现频率最高的核苷酸。欧洲栓皮栎的二基元SSR中也是GA重复最多,而蒙古栎中是CT重复最多,无梗花栎和夏栎则是AG和TC基元的SSR最多。在猕猴桃(Fraseretal.,2004)中频率最高的二核苷酸重复为CT与蒙古栎一致。而白桦的研究表明TC是分布频率最高的二基元SSR(王艳敏等,2008),与夏栎一致。不同三基元的SSR的分布频率在不同物种中差异较大。在白菜和拟南芥中GAA较多,而在水稻、大麦、高粱、玉米中CCG则是主要三核苷酸重复(Gaoetal.,2003),Kantety(2002)报道小麦三核苷酸SSR中占优势的类型是AAC。四种栎类的三基元SSR中分布频率最高的分别是,蒙古栎CTT基元,无梗花栎和夏栎的GAA基元,欧洲栓皮栎