杀菌剂种子处理对镰孢菌的致病力

杀菌剂种子处理对镰孢菌的致病力

玉米是中国的重要粮食。苗期的相关病害主要有苗枯病和根腐病,会造成缺苗、弱苗、根和胚轴腐烂等现象,进而影响后期的群体数量和产量。玉米苗病可由种传或土传病原菌引起,包括有曲霉菌(Aspergillus)、镰孢菌(Fusarium)、赤霉菌(Gibberella)、腐霉菌(Pythium)、丝核菌(Rhizoctonia)等,其中腐霉菌和镰孢菌是较常见的病原菌。就镰孢属(FusariumLink)来说,包含有数十个种,部分是对农作物生产危害比较普遍和严重的病原菌,如禾谷镰孢菌(F.graminearum)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)和层出镰孢菌(F.proliferatum),这些种镰孢菌既能通过种子传播,也可在土壤和农作物秸秆中存活,播种玉米后均可能侵染种子和植株,造成玉米的根腐、茎腐和穗腐等病害[5~7]。镰孢菌的寄主广泛,如引起玉米相关病害的禾谷镰孢菌,也是小麦赤霉病的病原,对黄淮海大面积小麦玉米连作区通过农业措施来防治相关病害是困难的,且还有加重相关病害发生的可能。目前,对于玉米种传和土传相关病害的防控主要通过杀菌剂拌种进行,但不同的杀菌剂其作用机理和防治对象可能不同,如克菌丹(Captan)和咯菌腈(Fludioxonil)是针对镰孢菌比较广谱的杀菌剂,而甲霜灵(Metalaxyl)和精甲霜灵(Mefenoxam)是针对卵菌比较专一的杀菌剂。侵染玉米的镰孢菌有多种,其传播途径也有自己的特点,同一种杀菌剂对不同镰孢菌种的抑菌效果和防效也可能不同,同一镰孢菌对不同的杀菌剂其敏感性也可能不同。本文选择目前市场上流通并常用的几种商业杀菌剂,对玉米种子进行拌种,通过室外盆栽试验和室内培养皿上的发芽试验,分析其对常见的几种镰孢菌的防效,并评估利用室内培养皿法检验杀菌剂处理玉米种子对镰孢菌的效果。1材料和方法1.1层出镰孢菌fevimss9及分子鉴定试验选用两个玉米品种:郑单958和浚单20,均为不包衣种子。选用禾谷镰孢菌F.graminearum(S19-1)、轮枝镰孢菌F.verticillioides(S99-4)和层出镰孢菌F.proliferatum(S88-1),均为本实验室2011年从河南省采集的玉米茎基部(茎基腐病株)上分离的菌株,并进行了形态和分子鉴定。选用4种杀菌剂:嘧菌脂、咯菌腈、精甲霜灵和克菌丹,获取的形式均为商业产品,采用单一或组合使用对玉米种子进行拌种(表1),咯菌腈+精甲霜灵和克菌丹种子处理用量依据其产品推荐用量,其他杀菌剂处理的用量参考相关文献的推荐用量,未处理种子作为对照(CK)。1.2注射准备参考王晓鸣等方法,将选定的镰孢菌菌株分别接种于玉米粒培养基上,培养10d后,待菌丝布满玉米子粒后用于接种。1.3不同密度玉米种子播种工艺,对种子长度和根腐将已灭菌的蛭石和沙子(体积比3∶1)混匀后作为基质,按照3%(接种体/基质)的浓度将接种体和基质混匀后装入直径25cm塑料花盆中,每盆约2.5kg。将装完基质的花盆浇水后过夜,第2天播种。在室外利用自然的光照和温度进行试验。2012年4月26日播种,将种子距离花盆边缘2cm呈圆形进行摆播,每盆播种10粒种子,作为1个小区。试验按完全随机区组设计,4次重复,未处理种子和未拌接种体的基质作为对照。播种后每两天浇水1次,保证基质的湿度。播种后8、13和20d分别调查出苗情况。21d后,将玉米苗从花盆中拔出并用水清洗后,分别测量根和地上部分的长度。对于根部腐烂情况的调查参考Lamprecht等方法,按照0~4级的分级标准:0为无根腐;1为0~25%根腐;2为25%~50%根腐;3为50%~75%根腐;4为75%~100%根腐。以上数据均单株调查,采用每个小区的平均数进行分析。每个小区的玉米苗在120℃杀青1h后,80℃连续烘干48h后称量干重。1.4种子萌发及腐烂参考Broders等的方法,选用直径8cm的培养皿,采用1.7%的WA(水琼脂)培养基,每皿约15mL。采用直径5mm的打孔器将PDA上的新鲜菌丝块转置在培养皿的中央,25℃下培养4d后,将10粒玉米种子呈圆形摆置于距离培养皿边缘1cm的WA上,其中对照种子先用3%的NaClO处理2min,25℃下培养,7d后调查种子发芽及腐烂情况。按照1~5级分级标准进行调查:1为种子萌发,健康的幼苗根部无明显侵染痕迹;2为极少被侵染,萌发,1%~19%幼苗根部有斑;3为部分被菌丝覆盖,萌发,20%~75%幼苗根部有斑;4为完全被覆盖,萌发,大于75%幼苗根部有斑;5为完全被覆盖,未萌发。1.5种子处理和镰孢菌菌株的比较利用SAS9.1(SASInstitute,Cary,NC)软件中的GLM程序进行方差分析,采用Waller-Duncank-ratio(k=100)法对种子处理和镰孢菌菌株进行比较(P≤0.05)。2结果与分析2.1玉米品种出苗率及根系生长情况在播种后8、13和20d,分别对盆栽试验的出苗情况进行调查,由于同一小区3次调查的结果几乎没有差别,因此采用第3次调查的数据进行方差分析。结果表明,出苗数除品种间差别显著外(P<0.05),菌株间、种子处理间等其他变异来源均不显著(表2)。3种镰孢菌菌株间的变异除出苗数不显著以外,苗高、根长、干重和根腐等均极显著(P<0.01),说明不同镰孢菌对玉米苗期的生长发育有不同的影响。种子处理间只有根长和干重的变异为极显著和显著,其余性状均不显著。对于品种和菌株的互作效应,除出苗数和根腐性状不显著外,其余3个性状均达显著或极显著水平,说明品种间的抗性存在差别。对于品种×种子处理、菌株×种子处理、品种×菌株×种子处理的互作效应,大多调查性状均不显著。两个玉米品种的出苗率均在90%以上,与对照相比,3种镰孢菌对出苗没有影响,郑单958的出苗率要好于浚单20(表3)。郑单958的3种接菌处理的苗高和对照相比没有显著差别,接种F.verticillioides菌株的苗高要显著高于接种另外两种镰孢菌的苗高;浚单20对照的苗高均高于接种处理,其中接种F.proliferatum菌株的苗高显著低于对照及接种F.graminearum和F.verticillioides菌株的苗高。两个品种接种镰孢菌的根长均分别大于对照,对于郑单958,其接种F.graminearum和F.verticillioides菌株的根长分别和对照差别显著,而接种F.proliferatum菌株的根长和对照差别不显著,但接种3种镰孢菌处理间的根长没有显著差别;对于浚单20,接种F.graminearum菌株处理的根长显著高于对照及接种F.verticillioides菌株的处理,接种F.verticillioides和F.proliferatum菌株处理的根长和对照差别不显著。两个品种接种镰孢菌处理的干重均低于对照,除接种F.verticillioides菌株的郑单958干重与对照差别不显著以外,其余接菌处理的干重均显著低于对照。两个品种接种处理间的根腐严重度与对照的差别均显著,其中菌株间根腐发生的严重度依次为F.graminearum>F.proliferatum>F.verticillioides>对照。两个玉米品种的5种种子处理和对照相比,在出苗数、苗高、干重和根腐性状方面差别均不显著(表4);对于根长,两个品种经药剂拌种处理均大于对照,但郑单958种子处理间及与对照相比均不显著;浚单20种子处理中除用咯菌腈+精甲霜灵拌种的根长显著大于对照以外,其余处理相比均不显著。2.2不同种子处理对镰孢菌菌株腐烂程度的影响培养皿法的方差分析结果表明,除了品种×种子处理间的互作效应不显著以外,其余变异来源均为显著或极显著(表2)。两个品种的接菌处理与对照差别均显著(表3)。对于郑单958,接种F.graminearum其种子发芽及腐烂严重程度显著于F.verticillioides和F.proliferatum,而后两者间的差别不显著;对于浚单20,3种镰孢菌接种处理间存在显著差别,其中腐烂严重度依次为F.graminearum>F.verticillioides>F.proliferatum>对照。同一菌株,两个品种间种子腐烂严重度的变化没有一致性。进一步对种子处理间进行比较,培养皿法的结果表明,两个品种经药剂拌种的腐烂程度均低于对照(表4),除了嘧菌脂拌种处理和对照差别不显著以外,其余拌种处理均和对照差别显著。两个品种药剂拌种处理中嘧菌脂拌种处理的腐烂程度显著高于其余4种药剂处理,而其余4种药剂处理间差别不显著。整体上来说,咯菌腈拌种处理效果最好,克菌丹或嘧菌脂+克菌丹的效果次之。统计分析结果表明,菌株与拌种处理间具有显著的互作,菌株间相比,F.graminearum比F.verticillioides和F.proliferatum具有更强的侵染力,各个种子处理中接种F.graminearum的腐烂程度均显著高于接种F.verticillioides和F.proliferatum及对照(表5),而F.verticillioides和F.proliferatum间差别均不显著。从菌落形态上观察,在菌株间及种子处理间也有一些不同,接种F.graminearum的所有种子处理均没有抑菌圈形成,而接种F.verticillioides和F.proliferatum菌株培养皿,经克菌丹或克菌丹+嘧菌脂处理的两个品种,在接种11d后,从培养皿背面观察,有一个环形的抑菌圈,但接种F.verticillioides的更明显,而相对防效较好的咯菌腈处理和单独使用的嘧菌脂处理,并没有发现形成抑菌圈现象(图1)。同一镰孢菌菌株,不同的种子处理和对照相比,除嘧菌脂处理和对照差别不显著以外,其余4种种子处理均与对照差别显著(表5)。接种F.graminearum的种子处理间差别均不显著;接种F.verticillioides的种子处理间,经嘧菌脂拌种的腐烂程度显著高于其余4种种子处理,而其余4种处理间差别不显著,但以咯菌腈处理的危害程度最轻;接种F.proliferatum的种子处理间相比,同样以咯菌腈处理的危害程度最轻,其与嘧菌脂及咯菌腈+精甲霜灵差别显著,其余均不显著。总的来说,咯菌腈对镰孢菌的防治效果最好。3活性成分的筛选本文采用室外和室内两种方法对相同的种子、菌株、种子处理进行比较分析,盆栽试验调查的几个性状中,除菌株间效应以外,多数效应不显著,而培养皿法的结果表明,多数效应表现为显著,二者方差分析的结果差别较大。两种试验方法的结果均表明,F.graminearum菌株比F.verticillioides和F.proliferatum菌株具有更强的侵染力,这与Munkvold&O’Mara的研究结果相同。对于种子处理试验,已发表的研究采用的方法有多环境下的大田试验[13~15]、温室条件下的盆栽试验或受环境影响较小的实验室内的检测等。尽管大田试验能够为种子处理的效果提供关键的数据,但不同地点或环境中可能存在不同的病原菌和微生物及他们间的互作等,很难明确某一拌种处理或杀菌剂对特定真菌种的效果,且大田试验存在许多不稳定的因素,比如Bradley对于大豆种子处理试验结果表明,多数环境下产量和根部性状没有明显的差别。本文采用盆栽试验方法,主要参考Lamprecht&Tewoldemedhin在分析F.graminearum复合种中不同进化种致病力差别的试验方法,主要区别在于本文将盆栽试验置于室外,而后者在温室中进行,这可能造成根腐程度存在差别。Lamprecht&Tewoldemedhin的结果表明,进化种的根腐级别在1~3级之间。相比较,Munkvold&O’Mara采用的是将一定浓度的镰孢菌孢子悬浮液接入基质中,将其置于温室中诱导其发病,对多个性状来说,种子处理间除了苯醚甲环唑与对照间表现显著差别以外,其余处理间均不显著,同本文的结果较相似,处理间变异较小。尽管本文的接菌量已经超过Lamprecht&Tewoldemedhin的实验接菌量,但由于本研究的盆栽试验置于室外,不能控制温度和空气湿度以及光照的变化,受环境的影响较大,发病级别平均多在1级以下,发病较轻,没有充分体现本文镰孢菌菌株的致病力,导致不能真正反映不同种子处理对不同镰孢菌的反应。培养皿法研究结果表明,多个变异来源是显著的,充分地说明试验方法的灵敏性,该方法还被用来分析不同F.graminearum菌株在玉米和大豆上致病力的差别。同样,Munkvold&O’Mara也采用培养皿法研究了镰孢菌和种子处理的相互影响,不同的是前者采用的是在培养基上接种一定量的孢子悬浮液,而本文接种的是一定体积的菌落,二者的结果均体现了该方法的灵敏性,且本文另外发现接种F.verticillioides和F.proliferatum菌株的培养皿,经克菌丹或克菌丹+嘧菌脂处理有一个明显的抑菌圈,表明克菌丹与不同镰孢菌种之间的互作有差别,这可能与克菌丹的作用机理有关。克菌丹为广谱、非内吸性杀菌剂,以保护作用为主,兼有一定治疗作用;嘧菌脂也为广谱性杀菌剂,但具有保护和治疗作用,有渗透和内吸活性,持效期15d左右