elisa试验中常见的影响因素

elisa试验中常见的影响因素

elisa是20世纪70年代开发的一种检测技术。由于其高度敏感、特异性强、操作简单等优点，它被广泛应用于各种抗原剂和抗原剂的测定。然而，有许多影响因素。在操作过程中，每个链接都会影响测试结果并得出错误的结果。现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下。1带说明书的操作要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂,严格按照说明书进行操作。注意在ELISA测定中将试剂盒在室温下放置20~30min后再进行测定,如从冰箱中拿出来即用可造成弱阳性标本的检测出现假阴性。2样本的要素2.1抗体假阳性的鉴定包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果。2.2外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。2.2.1血红蛋白浓度检测性,因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色,故严防标本溶血。2.2.2假阳性与假阳性反复冻融在用间接法测定中会导致本底过深,甚至造成假阳性。因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5d之内应4℃保存,长时冻存的样本避免反复融冻。2.2.3样品的不完全巩固血清中含有一些纤维原，可以认为结果是假阳性解决的方法有:将采集后的血液放入37℃水浴中1h,待充分凝固后再离心分离血清。3操作中的要素3.1挤压的量不优化孵育前加样时间过长,酶试剂加出孔外,使用滴瓶滴加试剂时,滴加的角度不同和挤压的力度不同,致使滴加的试剂量不准,都可导致试验结果不准确。控制方法:(1)实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差;(2)加酶试剂后,用吸水纸吸干孔外试剂;(3)作定量试验时,加样器应定期校准。3.2水浴箱或封片常用试剂盒为37℃30min~1h。为了避免标本或稀释液蒸发,注意孵育时贴封片或加盖,直接将微孔板浮于水浴箱的水中可受热均匀,有效避免“边缘效应”。若温育时间不够,易致弱阳性标本测不出来。3.3堵塞的控制方法一般有2种方式,即手工和洗板机洗板。采用手工洗板,孔与孔之间液体易交叉,采用半自动洗板机时,洗液量不足导致洗板不彻底,洗板针堵塞导致抽吸不完全,洗板不畅导致清洗效果差。控制方法:(1)手工洗板时,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;(2)洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅,若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出;(3)为了洗涤效果好,实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1~2次,或适当增加洗板的次数,有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果。3.4显色ELISA试剂盒中以四甲基联苯胺(TMB)为底物,提供的底物为A和B2瓶应用液,不需避光,但应尽量避免接触金属器械。3.5停止并结束避免加终止液时产生较多气泡而致假阳性增加。3.6elisa法测定标本的操作定量测定时用酶标仪读取结果,在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸,保持酶标板清洁。酶标仪不应置于阳光或强光照射下,需先预热15~30min再进行测试。综上所述,尽管ELISA法操作简单,但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中,除了选择优良试剂外,必须严格按照操作步骤进行操作,